Laura Antonia Peñaranda Rincón; Karen Johanna Sepúlveda Ortíz;
Yury Elena Álvarez Pacheco; Ángel Darío González-Delgado; Viatcheslav Kafarov*
Centro de Investigaciones para el Desarrollo Sostenible en Industria y Energía (CIDES)
Universidad Industrial de Santander (UIS), Cra. 27 Calle 9, Bucaramanga, Colombia.
*cisyc@uis.edu.co
Fecha Recepción: 7 de marzo de 2011
Fecha Aceptación: 25 de agosto de 2011
Al igual que una refinería de petróleo, una biorefinería utiliza todos los componentes de la biomasa para obtener productos aprovechables. Además de los lípidos, la biomasa de microalgas contiene cantidades importantes de proteínas, carbohidratos y otros productos metabólicos. En el presente estudio los autores definieron y evaluaron las rutas de obtención de lípidos y monosacáridos de biomasa de las microalgas Amphiprora sp. y Navicula sp., por medio de la implementación de procedimientos como disrupción celular ácida, extracción Soxhlet, Organosolv, transesterificación in situ y el método del ácido dinitrosalicílico (DNS). Las rutas fueron definidas y comparadas con base en las eficiencias de extracción de lípidos y porcentajes de azucares reductores obtenidos. Para la ruta de hidrólisis ácida - extracción Soxhlet se evaluaron diferentes tiempos, los mejores resultados se obtuvieron mediante los tiempos de 120 y 960 min, respectivamente. Mediante la ruta Organosolv - extracción Soxhlet la mayor eficiencia lipídica obtenida fue 48% y en transesterificación in situ el mayor porcentaje de azúcares reductores totales fue 1,67%p. Además, se determinaron los parámetros cinéticos relacionados con el sistema de lisis celular y transesterificación in situ para Navicula sp., obteniendo constantes de K=0,0003 min-1 para azúcares reductores y K=0,02 min-1 para productos de degradación. Por medio de espectroscopía infrarroja se comparó el pico de absorción del grupo carbonilo característico del biodiésel a través del tiempo. Entre las rutas evaluadas, Organosolv - extracción Soxhlet y transesterificación in situ presentaron mayor obtención de lípidos y monosacáridos, respectivamente.
Palabras clave: pretratamiento, extracción, integración de procesos, azúcares reductores.
As an oil refinery, a biorefinery uses all biomass components for obtaining high value usable products. Besides lipids, microalgae biomass contains significant amounts of proteins, carbohydrates and other metabolic products. In the present study, the authors defines routes to obtain monosaccharides and lipids from microalgae biomass of Amphiprora sp. and Navicula sp., through the implementation of acidic cellular disruption procedures, Soxhlet extraction, Organosolv pretreatment, in situ transesterification and the dinitrosalicylic acid method (DNS). The routes were defined and compared based on the percentage of lipids and monosaccharides obtained. For acid hydrolysis - Soxhlet extraction route several times of acid hydrolysis and extraction were evaluated, the best results for this route were obtained using times of 120 and 960 min, respectively. By Organosolv - extraction Soxhlet route, the best lipid efficiency obtained was 48% and in situ transesterification the highest percentage of total reducing sugars was 1.67%wt. Furthermore, kinetic parameters were determined related to the system of cell lysis and in situ transesterification for Navicula sp., getting constants K=0.0003 min-1 for reducing sugars and K=0.02 min-1 for degradation products. Using infrared spectroscopy compared the absorption peak of carbonyl group characteristic of biodiesel over time. Among Organosolv - Soxhlet extraction routes and in situ transesterification - Soxhlet extraction showed higher production of lipids and monosaccharides, respectively.
Keywords: pretreatment, extraction, process integration, reducing sugars.
El uso continuo de combustibles derivados del
petróleo se reconoce como insostenible debido al
agotamiento de los suministros y la contribución
de éstos a la contaminación del medio ambiente.
Al igual que una refinería de petróleo, una
biorefinería utiliza todos los componentes del
material de la biomasa para obtener productos
aprovechables [1]. Los biocombustibles de
tercera generación provenientes de microalgas
ofrecen una excelente alternativa para desplazar
a los combustibles fósiles [2].
La producción de biodiésel a partir de aceite de
microalgas implica la extracción de los lípidos
de la biomasa, seguido por su conversión a
alquil ésteres y glicerol [3]. Los polisacáridos,
pueden ser hidrolizados para obtener azúcares
reductores a los que se les aplica el proceso de
fermentación para producir bioetanol [4]. En el
presente estudio se definen y evalúan las rutas
de obtención de lípidos, monosacáridos y ésteres
de ácidos grasos de biomasa de las microalgas
Amphiprora sp. y Navicula sp., por medio de la
implementación de los métodos de disrupción
celular ácida, extracción Soxhlet, Organosolv, y
transesterificación in situ.
Se utilizó la biomasa de las microalgas Amphiprora sp. y Navicula sp. proporcionada por la Corporación Instituto de Morrosquillo (Punta Bolívar, Colombia), la cual fue cosechada por floculación y filtración. La caracterización de la biomasa fue realizada por el Instituto Colombiano del Petróleo (ICP), los datos se presentan en la Tabla 1 los cuales son porcentajes en base seca. Cabe resaltar que el alto porcentaje de cenizas se debe al floculante empleado, el cual afecta negativamente el contenido propio de los metabolitos de las microalgas.
La biomasa de las microalgas se pretrató mediante hidrólisis ácida y Organosolv [5]. Los azúcares reductores totales presentes en el licor de cada pretratamiento fueron cuantificados mediante el método del ácido dinitrosalicílico (DNS) descrito por Miller [6]. Seguidamente, la biomasa fue sometida a extracción Soxhlet. Además, se llevó a cabo el sistema multifuncional, el cual permitió realizar conjuntamente los tratamientos de disrupción celular, extracción de aceites y transesterificación in situ [7].
Hidrólisis - extracción Soxhlet
Se empleó el método de hidrólisis ácida a cada
una de las microalgas en estudio, Amphiprora sp.
y Navicula sp., el cual consistió en una solución
compuesta por 10 g de biomasa y ácido clorhídrico
0,5 M, de acuerdo con la metodología desarrollada
por Kafarov et al. [8]. Se sometió a agitación a una
velocidad de 500 rpm durante 30, 60 y 120 min a
temperatura ambiente. Se seleccionó este rango
de tiempo para no incurrir en gastos energéticos
innecesarios, y evitar la degradación de los
metabolitos de interés. Una vez transcurrido este
tiempo, se filtró al vacío y se lavó la biomasa hasta
alcanzar un pH cercano a 7, obteniendo de esta
manera biomasa hidrolizada e hidrosoluble. Dicha
biomasa hidrosoluble o licor fue tratada según el
método DNS para determinar la concentración de
azúcares reductores totales (ART). La biomasa
hidrolizada se secó a 105°C durante 240 min, para
realizar posteriormente extracción lipídica.
Los lípidos presentes en la biomasa hidrolizada
de cada una de las microalgas fueron extraídos
haciendo uso del solvente orgánico, hexano, en
un equipo Soxhlet [9], durante 480, 720 y 960 min
de lavado repetitivo. Con la utilización de tiempos
mayores a 960 min, se incurriría en pérdidas
significativas de solvente y en mayor ingreso de
energía al sistema, poco justificable si el producto
a obtener al final de la cadena de producción son
biocombustibles. Se emplearon los porcentajes
de lípidos reportados en la caracterización para
Amphiprora sp. y Navicula sp. (Tabla 1), y las
siguientes ecuaciones para calcular el porcentaje
de extracción y la eficiencia lipídica:
Organosolv - extracción Soxhlet
Esta ruta consiste en una disrupción celular a alta
temperatura y a presión controlada, la cual es
promovida por un arrastre de vapor y un solvente
orgánico, seguida de una extracción Soxhlet con
hexano. Para la disrupción celular se utilizaron
las condiciones de operación determinadas por
Meza y Sepúlveda [10]. Después de la disrupción
se realizó un lavado de la biomasa de Navicula
sp. con el fin de neutralizar el pH, seguido a esto
la biomasa pretratada se secó en horno a 105 °C
durante 240 min. Al licor obtenido después de la
filtración, se le determinó concentración de ART
por medio del método DNS. La biomasa seca se
homogenizó y fue sometida a extracción Soxhlet,
tomando como condiciones de operación aquellas
que brindaron las mayores eficiencias durante la
evaluación de la ruta hidrólisis ácida - extracción
Soxhlet. La cuantificación de los lípidos obtenidos
se realizó mediante gravimetría por volatilización y
se calculó la eficiencia lipídica de la prueba.
Sistema multifuncional
Con base en el contenido teórico de aceite de
la microalga Navicula sp. se determinó una
proporción de 1:6 de biomasa-etanol. Lo anterior
se realizó con el propósito de impulsar la reacción
en dirección de los ésteres etílicos (Modificado
de Ehimen et al. [3] y Johnson et al., [11]). Se
utilizó ácido sulfúrico (H2SO4) como catalizador
ácido de la transesterificación, en relación másica
de aceite-ácido 1:1 (Modificado de Johnson et
al., [11] y Plata et al. [12]). Estas reacciones se
sometieron a una velocidad de agitación de 500
rpm, a una temperatura de 60°C durante 1440
min, tomándose una muestra a intervalos de
tiempo variables. Adicionalmente, se implementó
una separación de lípidos neutros con hexano a
cada muestra, con el fin de aislar los componentes
lipídicos y etil-ésteres de la biomasa residual y de
la fase hidroalcohólica donde quedan contenidos
los ART y demás componentes polares. Dichos
componentes que migran a la fase hexánica se
sometieron a pruebas de infrarrojo. Los espectros
se obtuvieron en un equipo Shimadzu FTIR-8400S
en el rango de longitud de onda de
400 - 4000 cm-1, se utilizó el Software IRSolution y
una celda de 2,5 cm de diámetro. Para cuantificar
los lípidos no extraídos ni transesterificados, se
realizó extracción de lípidos a la biomasa residual.
Modelamiento cinético
Mediante el software Matlab® y la herramienta Solver
en Microsoft Excel® se calcularon los parámetros
cinéticos relacionados con el sistema multifuncional.
Adicionalmente, se realizó una simulación con base
en los parámetros y el modelo encontrado para
la obtención de azúcares reductores a diferentes
temperaturas y concentraciones de ácido de la
microalga Navicula sp.
Influencia del tiempo de disrupción en el
porcentaje de extracción
En la Figura 1 se muestra el porcentaje de
extracto lipídico obtenido para diferentes tiempos
de disrupción celular ácida en Amphiprora sp.
La biomasa tratada durante 30, 60 y 120 min se
sometió a extracción Soxhlet por 960 min. Por
medio del pretratamiento de hidrólisis ácida durante
120 min, incrementó la eficiencia de extracción
lipídica, obteniendo un mayor resultado, 39%, en
comparación con los realizados para 30 y 60 min
de pretratamiento. De acuerdo con González et al.
[7], esta diferencia se puede presentar por el grado
de lisis celular, es decir, ruptura a nivel de la pared
celular de la microalga en relación con el tiempo
de contacto con el agente disruptor, permitiendo
que los lípidos estén expuestos en mayor o menor
medida al solvente de extracción, lo cual incide
en el porcentaje de extracto lipídico obtenido.
Se estableció, entonces, como mejor tiempo de
disrupción celular, 120 min, el cual se implementó
en posteriores experimentos.
Efecto de la variación del tiempo para extracción
Soxhlet
Se implementaron diferentes tiempos de
extracción Soxhlet con el propósito de establecer
el mejor tiempo con base en la eficiencia lipídica
obtenida. Durante 960 min de extracción se obtuvo
una eficiencia de 39%, comparativamente mayor
respecto a 22,5% para 480 min y 26,3% para 720
min de extracción (Figura 2).
Se definió la ruta hidrólisis ácida - extracción
Soxhlet, con tiempos de reacción de 120 y 960 min,
respectivamente, donde se obtuvo una eficiencia
de extracción lipídica de 39% para Amphiprora
sp. y 40% para Navicula sp. Mediante esta ruta se
obtuvieron eficiencias lipídicas similares para las
microalgas en estudio.
De la misma forma, se fijó 960 min de extracción
para la ruta Organosolv - Extracción Soxhlet,
obteniéndose una eficiencia lipídica de 48% para
Navicula sp., valor superior al obtenido mediante
la ruta hidrólisis ácida - Extracción Soxhlet, lo cual
indica un mejor desempeño del pretratamiento
Organosolv frente a la hidrólisis ácida.
Modelamiento cinético de la producción de monosacáridos
El comportamiento del Material Polisacárido de
Microalgas (MPM) se muestra en la Ecuación 3.
De acuerdo al modelo desarrollado por Téllez-Luis
et al. [13], se describe una reacción consecutiva
de primer orden con dos pasos irreversibles,
donde AR se refiere a azúcares reductores y PD,
productos de degradación.
A continuación se presentan las ecuaciones cinéticas que describen el cambio del MPM y los productos:
La Ecuación 4 expresa la velocidad de reacción
de monomerización de polisacáridos, la Ecuación
5 describe la velocidad de producción de azúcares
reductores, donde C es la concentración de MPM
y A es la concentración de azúcares reductores
totales. Se presenta también la ecuación de
Arrhenius donde se relaciona la constante de
velocidad Ki en función de la temperatura (Ec.
6). La Ecuación 7 se obtuvo mediante desarrollo
matemático, ésta relaciona la concentración de
azúcares reductores totales, con las constantes
de velocidad y el tiempo. Los valores numéricos
de la Ecuación 7 están basados en el material
polisacárido de microalgas reportado por Ververis
et al. [14].
Los parámetros cinéticos fueron estimados
mediante el software MatLab®. Se encontraron las
constantes de velocidad de reacción, K1 y K2, y por
medio de la herramienta Solver se obtuvieron los
demás parámetros.
Con los parámetros hallados se estableció el
modelo cinético. Se simuló el comportamiento de
la concentración de azúcares reductores totales
a diferentes temperaturas y concentraciones de
ácido sulfúrico. La mayor cantidad de ART según
el modelo encontrado se obtuvo alrededor de
200 min, estabilizándose hasta los 350 min de
reacción. Posteriormente, se presentó una ligera
degradación de los azúcares reductores totales.
Este comportamiento se observó debido a la
ruptura celular llevada a cabo por el ácido sulfúrico
y la degradación de los ART por el tiempo de
contacto con el mismo (Figura 3). Cabe señalar la
doble función del ácido en este sistema, hidroliza
el material polisacárido formando monómeros y
dejando libres los lípidos presentes en la microalga.
Se espera entonces que en una posterior
validación de este modelo, concentraciones
bajas de ácido permitan menor degradación de
azúcares reductores y por tanto obtener mayor
concentración de los mismos a lo largo del
tiempo (Figura 4).
Se modeló el efecto de la variación de la
temperatura sobre la concentración de ART en el
tiempo, manteniendo una concentración de ácido
sulfúrico de 20 mg/mL. En la Figura 5 se observa
que la rapidez en la producción de azúcares
reductores totales aumentó notoriamente para
una temperatura de 140°C hasta un tiempo de 75
min, obteniendo una concentración máxima de
0,38 mg/mL.
Así mismo, la degradación de azúcares reductores ocurrió más rápidamente después del tiempo mencionado anteriormente. Al disminuir la temperatura a 25°C, se afectó la rapidez de formación de ART, es decir, la concentración de azúcares reductores fue menor y la degradación más lenta en comparación con temperaturas superiores. El modelo demuestra también la conveniencia de utilizar tiempos cortos de hidrólisis para evitar así, una posterior degradación de los azucares reductores.
Comparación de los picos de absorción del
grupo carbonilo en el tiempo
Los espectros obtenidos mediante espectroscopía
infrarroja con transformada de Fourier (FTIR),
indicaron un aumento del área de la banda
correspondiente al enlace carbonilo (C=O) sobre
1750 cm-1 y la banda que constituye las cadenas
alifáticas entre los 2800 y 3000 cm-1 desde 120
min de reacción. Estas son bandas asociadas a
los ésteres, demostrando que en el transcurso del
tiempo de reacción se da la formación de esteres
etílicos o biodiésel (Figura 6). Durante el proceso
multifuncional, la ruptura celular libera los lípidos
a través del tiempo, permitiendo el incremento en
la formación de ésteres etílicos.
Además, se realizó FTIR para muestras
obtenidas mediante la ruta de hidrólisis ácida -
extracción Soxhlet (Figura 7). En los espectros
IR de las muestras de extracto lipídico y la fase
hexánica de 240 min se identificó la banda de
cadenas alifáticas a 2918 cm-1. El enlace éster
aparece tanto en lípidos como en biodiésel [15]
[16], este enlace carbonilo (C=O) para lípidos se
encontró a 1704 cm-1 y para ésteres etílicos a
1750 cm-1. En el espectro de la muestra tomada
del sistema multifuncional (Figura 7b) apareció
un pico a 3400 cm-1, que corresponde al enlace
OH, característico en espectros de glicerina [17].
Lo anterior se atribuye al origen del biodiésel,
el cual proviene de un sistema multifuncional
donde no hubo un proceso de purificación de
los productos.
Los espectros IR obtenidos para esteres etílicos fueron comparados con espectros IR de lípidos de microalgas y aceite y ésteres etílicos de palma Tabla 3. El enlace éster para lípidos de microalgas comprende la región de 1654 a 1746 cm−1 [15], lo cual coincide con la banda encontrada a 1704 cm-1. En el espectro IR para ésteres etílicos a partir de aceite de palma [18] y de la microalga Navicula sp., el enlace carbonilo se identificó a la misma longitud de onda, 1750 cm-1.
Comparación de rutas de obtención de lípidos
y monosacáridos
Por medio de la ruta Organosolv - extracción
Soxhlet se obtuvo un valor de eficiencia lipídica de
48%, para la ruta de hidrólisis ácida - extracción
Soxhlet una eficiencia de 40% y finalmente para
el sistema multifuncional - extracción Soxhlet
una eficiencia de 4,8%. Por lo tanto, se escogió
la ruta Organosolv - extracción Soxhlet, donde
se obtuvo la mayor eficiencia de extracto lipídico.
La biomasa separada después del proceso de
ruptura celular y transesterificación in situ fue
sometida a extracción Soxhlet con el fin de
determinar y cuantificar la cantidad de aceite
remanente, como se muestra en la Figura 8, existe
una cantidad de aceite en la biomasa que no fue
extraído durante el tiempo de implementación del
sistema multifuncional.
Por medio de transesterificación in situ se
obtuvo la mayor concentración de azúcares
reductores totales, 1,67%p, en comparación
con hidrólisis ácida y Organosolv (Tabla 4).
La obtención de azúcares reductores totales por medio de los procedimientos señalados estuvo relacionada con el tiempo de contacto con el agente disruptor. Las muestras tomadas a intervalos de tiempo variables en el método de transesterificación in situ revelaron mayor concentración de ART debido a la exposición irregular con el ácido sulfúrico.
Al incrementar el tiempo de operación de los
métodos hidrólisis ácida y extracción Soxhlet se
aumenta la obtención de aceite en las microalgas
Amphiprora sp. y Navicula sp. A su vez mediante
el modelamiento cinético se comprueba que al
emplear tiempos menores a 120 min de hidrólisis
se disminuye la posibilidad de degradación
de los productos de interés. Mediante la ruta
Organosolv - Extracción Soxhlet se obtuvo
la eficiencia lipídica más alta respecto a las
demás rutas.
Bajo las condiciones evaluadas en el sistema
multifuncional se obtuvieron tanto ésteres etílicos
como azúcares reductores totales, estos últimos
con el mayor porcentaje obtenido respecto a
las demás rutas definidas. De acuerdo al los
modelos propuestos para este sistema, a menor
concentración de ácido, aumenta la producción
de ART. En contraste, a mayor concentración de
ácido sulfúrico la producción de ART disminuye
e inicia a menor tiempo la degradación. Siendo
esto algo conveniente, pues la menor adición
de ácido, es favorable económicamente para el
proceso, a su vez, disminuye el riesgo de degradar
productos valiosos. Sin embargo, es necesario
validar el modelo con datos experimentales a
las condiciones más favorables encontradas
mediante el modelamiento. La producción de
ésteres etílicos bajo este sistema, se detectó con
espectroscopía infrarroja con transformada de
Fourier, encontrándose la mayor producción en
un tiempo cercano al que se da también la mayor
producción de ART. Se puede considerar entonces
que la obtención conjunta de los metabolitos
mediante esta ruta no requiere de largos periodos
de tiempo. Bajo un concepto de biorefinería
y considerando un posterior escalamiento del
proceso, la ruptura celular y transesterificación in
situ como un sistema multifuncional, se considera
como la mejor ruta para obtención de azúcares
reductores totales y ésteres de biodiésel.
Los autores agradecen al Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural por su apoyo mediante el proyecto 2008D32006-6710 "Bioprospección de microalgas colombianas para la producción de biodiesel", al Instituto Colombiano del Petróleo ICP-ECOPETROL, al Departamento Administrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación COLCIENCIAS, a la Universidad Industrial de Santander, a la Corporación Instituto de Morrosquillo y al Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo CYTED.
[1] Khan SA, Rashm R, Hussain Z, Prasad S, Banerjee UC. Prospects of biodiesel production from microalgae in India. Renew Sust Energ Rev. 2009;13:2361-72.
[2] Beer LL, Boyd ES, Peters JW, Posewitz MC. Engineering algae for biohydrogen and biofuel production. Curr Opin Biotechnol. 2009;20(3):264-71.
[3] Ehimen EA, Sun ZF, Carrington CG. Variables affecting the in situ transesterification of microalgae lipids. Fuel. 2010;89:677-84.
[4] Fu ChCh, Hung TCh, Chen JY, Su ChH, Wu WT. Hydrolysis of microalgae cell walls for production of reducing sugar and lipid extraction. Biores. Technol. 2010;101:8750-4.
[5] Dias MOS, Ensinas AV, Nebra SA, Maciel R, Rossell CEV, Wolf MR. Production of bioethanol and other bio-based materials from sugarcane bagasse: Integration to conventional bioethanol production process. Chem. Eng. Res. Des. 2009;87:1206-16.
[6] Miller GL. Use of Dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal. Chem. 1959;31:426-8.
[7] González D, Kafarov V. Design of a multifunctional reactor for third generation biofuels production. Chem. Eng. Transact. 2010;21:1297-302.
[8] Kafarov V, Sarmiento R, Amaya A, González A. Desarrollo de una metodología para la extracción de aceite de microalgas empleando disrupción celular térmica y química. Memorias del XXIX Congreso Latinoamericano Química; 2010 Sep 27- Oct 01; Cartagena, Colombia, p.100.
[9] Córdoba LS, López LM, González AD, Kafarov V. Obtención de aceite de microalgas nativas a escala de laboratorio mediante la combinación de disrupción celular y método de extracción Soxhlet para la producción de biodiésel. Memorias del XXIX Congreso Latinoamericano de Química; 2010 Sep 27-Oct 01; Cartagena, Colombia, p.103.
[10]Meza Santos AP, Sepúlveda Soto AJ. Estudio del pretratamiento metanol-ácido de la microalga Chaetoceros gracilis para la obtención de azúcares reductores totales (trabajo de grado). Bucaramanga, Colombia: Universidad Industrial de Santander; 2010.
[11] Johnson MB, Wen Z. Production of Biodiesel fuel from the microalga Schizochytrium limacinum by direct transesterification of algal biomass. Energy Fuels. 2009;23:5179-83.
[12] Plata V, Kafarov V, Moreno N. Optimization of third Generation biofuels production: Biodiesel from microalgae oil by homogeneous transesterification. Chem. Eng. Transact. 2010;21:1201-6.
[13] Téllez-Luis SJ, Ramírez JA, Velásquez MV. Mathematical modelling of hemicellulosic sugar production from sorghum Straw. J. Food Eng. 2002;52:285-91.
[14] Ververis C, Georghiou K, Danielidis D, Hatzinikolaou DG, Santas P, Santas R, Corleti V. Cellulose, hemicelluloses, lignin and ash content of some organic materials and their suitability for use as paper pulp supplements. Biores. Technol. 2007;98:296-301.
[15] Laurens LM, Wolfrum EJ. Feasibility of spectroscopic characterization of algal lipids: chemometric correlation of NIR and FTIR spectra with exogenous lipids in algal Biomass. Bioenerg. Res. 2011;4(1):22-35, DOI 10.1007/s12155- 010-9098-y.
[16] Aliske MA, Zagonel GF, Costa BJ, Veiga W, Saul CK. Measurement of biodiesel concentration in a diesel oil mixture. Fuel. 2007;86:1461-4.
[17] Ooi TL, Yong KC, Dzulkefly K, Wan Yunus WMZ, Hazimah AH. Crude glycerine recovery from glycerol residue waste from a palm kernel oil methyl ester plant. J. Oil Palm Res. 2001;13(12):16-22.
[18] Martínez ÓM, Sánchez FJ, Suárez ÓY. Producción de ésteres etílicos a partir de aceite de palma RBD. Ing. e invest. 2007;27(2):34-43.