Andrés Fernando Barajas Solano^*; Carlos Augusto Godoy Ruiz; Juan David Monroy Davila; Crisóstomo Barajas Ferreira; Viatcheslav Kafarov.

Escuela de Ingeniería Química. Universidad Industrial de Santander (UIS)
Cra 27 Calle 9, Bucaramanga, Colombia
^*andresfdobarajas@gmail.com

Fecha Recepción: 6 de febrero de 2012
Fecha Aceptación: 11 de septiembre de 2012

Las microalgas han sido sugeridas como una respuesta adecuada para la producción de combustibles debido a sus ventajas relacionadas con altas tasas de crecimiento, alta eficiencia fotosintética y alta producción de biomasa comparada con otros cultivos terrestres energéticos.
Se estudió el efecto de la inyección continua de CO₂ sobre la productividad de biomasa de Chlorella vulgaris UTEX 1803 a escala de laboratorio. Los cultivos se realizaron en condiciones autotróficas a 23±1°C, con ciclos luz-oscuridad 12:12h durante periodos establecidos de 5 días. Los cultivos se efectuaron a concentraciones de NaNO₃ (0,59mM; 1,18mM; 1,76mM; 2,35mM) y flujos continuos con 2,3 y 3,8%v de CO₂. Todos los experimentos fueron desarrollados por triplicado. Los resultados obtenidos en los diferentes experimentos muestran que las mejores productividades fueron 0,28(g/l.dia) y 0,44(g/l.dia) utilizando 2,3%v de CO₂, 0,59mM NaNO₃ y 3,8%v de CO₂, 1,18mM NaNO₃ respectivamente, indicando que la cantidad de CO₂ influencia genera la mayor influencia en el crecimiento de C. vulgaris. Sin embargo, al disminuir la concentración de nitrógeno, es posible obtener una mayor productividad de biomasa, esto representa un avance importante en la producción de cultivos fotosintéticos, ya que abre las posibilidades para mejorar la producción total de biomasa mientras se reduce los costos en la producción.

Palabras clave: microalgas, Chlorella vulgaris, cultivo autotrófico, dióxido de carbono, fotobioreactores.

Microalgae have been suggested as an appropriate response to the production of fuels due to their advantages associated with high growth rates, high photosynthetic efficiency and high production of biomass compared to other terrestrial energy crops.
This work focuses on the effect of continuous inyection of CO₂ on biomass productivity of Chlorella vulgaris UTEX 1803 on labscale photobioreactors. Autotrophic cultures were carried out on 23±1°C, with light:dark cicles of 12:12, also different fluxes of CO₂ (2.3 and 3.8 v%) and different concentrations of sodium nitrate (0.59mM; 1.18mM; 1.76mM; 2,35mM) were tested.
Results obtained in the different experiments show that the best productivity were 0.28 (g/l.dia) and 0.44(g/l.dia) using 2.3v% de CO₂, 0.59mM NaNO₃ and 3.8v% de CO₂, 1.18mM NaNO₃ respectively, Indicating that the amount of CO₂ influence generates the greatest influence on the growth of C. vulgaris. However, by lowering the concentration of nitrogen, it is possible to obtain a higher productivity of biomass. This represents an important advance in photosynthetic crop production, as it opens the possibilities to improve the total biomass production while reducing costs production.

Keywords: microalgae, Chlorella vulgaris, autotrophic cultures, carbon dioxide, photobioreactors.

El calentamiento global es un serio problema ambiental, el cual se atribuye principalmente a los gases de efecto invernadero como el metano, ozono troposférico, clorofluorocarbonados y dióxido de carbono (CO₂) [1], este último es considerado el principal Gas de Efecto Invernadero (GEI) [2, 3, 4] y se estima que sus emisiones anuales aumentaron un 80% entre 1970 y 2004, afectando la estabilidad económica, social y ambiental del planeta [5]. Por ello su mitigación y utilización se ha estudiado de manera considerable [6].
Las microalgas representan alrededor del 0,5% de la biomasa global, además presentan ventajas tales como la alta tasa de crecimiento, alta eficiencia fotosintética y alta producción de biomasa comparada con otros cultivos terrestres [7, 8], es por esto que pueden llegar a producir alrededor del 70% del oxígeno neto en la tierra, por lo que se ha considerado 10 a 50 veces más eficientes en fijación de CO₂ que las plantas terrestres [9]. Emplear este tipo de cultivos para la biofijación de dióxido de carbono, tiene el potencial, no sólo de reducir los costos en la obtención de productos de valor agregado (biodiesel y otros) sino también la compensación de las emisiones de carbono [6, 9, 10, 11].
Basados en literatura, las microalgas pueden fijar cerca del 9% de la luz solar incidente, la cual pueden aprovechar para generar hasta 280 ton de biomasa seca/ha.año, mientras consume cerca de 513 toneladas de CO₂ [3]. Además pueden fijar CO₂ del ambiente en lugares con concentraciones 1000 veces más altas que las ambientales, lo cual podría ser útil para controlar los altos niveles de CO₂ industriales [12]. El CO₂ fijado es utilizado en la síntesis de diferentes biomoleculas de valor agregado como proteínas, carbohidratos, pigmentos y lípidos, los cuales a su vez pueden ser aprovechados para la obtención de diferentes productos tales como alimentos, combustibles y otros [6, 9]. La fijación del CO₂ por medio de microalgas es ecológicamente sostenible cuando se combina con otros procesos de protección ambiental tales como el tratamiento de aguas residuales [13] o la remoción de metales pesados [14]. Sin embargo la tasa de inyección y la transferencia eficiente del CO₂ al medio de cultivo junto con la intensidad de luz son los mayores factores en la asimilación fotosintética del carbono en plantas y en otros organismos fotosintéticos [15-18]. Según Pulz O [18], el balance entre CO₂/O₂ es también un factor primordial en el logro de una mayor tasa fotosintética. Así por ejemplo, un exceso de oxígeno (CO₂/O₂) reducirá significativamente las velocidades de crecimiento celular, sin embargo la relación CO₂/ O₂ que evita la foto-oxidación varia de organismo en organismo [19], por lo cual los cultivos fototróficos pueden no alcanzar siempre altas tasas de crecimiento y productividad [20].
La cantidad de luz requerida para la fotosíntesis es aproximadamente de un quinto a una decima parte de la cantidad de luz disponible al medio día [19]. La tasa de crecimiento aumenta, de la misma manera que aumenta la irradiación de luz hasta una irradiación máxima, en la cual el crecimiento es inhibido, generando un fenómeno conocido como fotoinhibición [21-25], esta es una de las mayores causas en la reducción de la productividad del alga [26]. A una mayor densidad celular en el cultivo, menor será la cantidad de luz que puede penetrar al mismo sin embargo este aumento en la densidad celular propone otros riesgos para el cultivo, ya que produce efectos de sombra entre las células, el cual decrece la intensidad, lumínica exponencialmente desde la superficie del cultivo hasta el centro de éste, generando así una gran zona oscura en el centro del cultivo y una pequeña zona iluminada cerca de la superficie donde la fotosíntesis puede ocurrir [27-29].
La fuente de carbono es el mayor contribuyente en la producción de biomasa para la microalga. El carbono puede ser agregado en compuestos orgánicos como la peptona o ácido acético, o en compuestos inorgánicos como el dióxido de carbono [19]. Durante la fotosíntesis, las microalgas pueden fijar el dióxido de carbono de diferentes fuentes, incluida la atmósfera, gases industriales de chimenea y soluciones salinas de carbonato (NaHCO₃ y Na₂CO₃) [8].
La fijación del CO₂ por parte de las microalgas implica un crecimiento fotoautotrófico de las células; la capacidad de fijación del CO₂ para algunas especies, puede estar relacionada con el crecimiento de las células y el adecuado aprovechamiento de la luz [15, 30]. Además, la eficiencia de la fotosíntesis en microalgas decrece con un incremento de la temperatura, ya que la solubilidad del CO₂ decrece de manera significativa [18].
La disolución del dióxido de carbono en el agua es compleja debido a las reacciones reversibles en fase líquida, las cuales generan 4 especies diferentes en el medio (dióxido de carbono, CO₂, ácido carbónico, H₂CO₃, ion bicarbonato, HCO₃-, e ion carbonato, CO₃⁼) cuyas concentraciones en equilibrio dependen del pH [31]. Además, el crecimiento celular depende de la velocidad de asimilación del CO₂, su velocidad de flujo, el tamaño de burbuja y el tiempo de residencia de la burbuja [31, 32]. En general, obtener una amplia área de interface gas/líquido es el primer paso vital para aumentar la transferencia de masa del CO₂ [32, 17]. Sólo una baja fracción del dióxido de carbono inyectado se incorpora a la biomasa de las microalgas. Utilizando únicamente el CO₂ presente en el aire (0,036%) se obtiene una baja productividad. Por lo tanto la solución a este déficit es mezclar CO₂ con aire en bajas proporciones del total del flujo de gas para obtener un buen crecimiento [21, 29, 33, 34, 35].
Dentro de la gran diversidad de microalgas, se ha encontrado que C. vulgaris es un organismo altamente eficiente en la fijación del CO₂ debido a su habilidad de crecer en medios enriquecidos con altas concentraciones de este gas [36, 37]. lo cual le confiere una gran ventaja sobre otras especies del mismo género [38, 39]. Según estudios realizados por Jeong ML et al. [6] y Lv JM et al. [40], la fijación de CO₂ por C. vulgaris requiere de ciertos parámetros como pH 5,7, además de un balance entre las diferentes especies de carbono. Para este caso, se encontró que el medio cultivo contenía 4,61x10^-3M de CO₂ acuoso (H₂CO₃) y 8,92x10^-4M del ion bicarbonato (HCO₃^-), lo cual indica para la fijación del CO₂, que C. vulgaris puede utilizar estas dos especies químicas. Sin embargo, para lograr un secuestro eficiente es necesario tener en cuenta ciertos factores abióticos del medio de cultivo, dentro de estos el más influyente es el nitrógeno [41, 42, 43, 44, 45], el cual mediante diferentes rutas metabólicas regula significativamente la producción y composición de la biomasa microalgal.
El estrés generado por déficit de nitrógeno, en comparación con el recurso de carbono, puede afectar la respuesta de las células a la disponibilidad de nutrientes y por tanto afectar las tasas de crecimiento y el consumo de la fuente de carbono, [41]. Para el caso del CO₂, su metabolismo está fuertemente relacionado con la asimilación del nitrógeno (tanto de NO₃ - como de NH₄⁺) debido al costo energético celular [46, 47], ya que hasta el 55% del carbono asimilado está comprometido para la asimilación y metabolismo del nitrógeno [45], por lo cual es posible mejorar la tasas de fijación de CO₂ mediante una regulación en el contenido de carbono y nitrógeno presente en el medio. Sin embargo, aun conociendo la existencia de esta dependencia metabólica, no es posible generalizar la relación carbono/ nitrógeno en microalgas, dado que existe un potencial para perturbar los organismos mediante la modificación de otros factores abióticos como: intensidad lumínica, pH y otros [48]. Además existen diferencias entre las especies y grupos de microalgas, tanto en la rapidez y magnitud de las respuestas como en el umbral que hace significativas estas respuestas [41].
Para el caso de Chlorella vulgaris la regulación en la concentración inicial de nitrógeno se ha enfocado principalmente en el aumento en el contenido lipídico [49, 50, 51]. Sin embargo, no existen estudios en los cuales se evalué el efecto de la relación entre la fuente de carbono (ya sea orgánico o inorgánico) y de nitrógeno, por lo cual el objetivo de este trabajo fue mejorar el secuestro de CO₂ por Chlorella vulgaris UTEX 1803 en fotobiorreactores a escala laboratorio mediante un ajuste en la relación Carbono/Nitrógeno.

Métodos de cultivo
La microalga Chlorella vulgaris UTEX 1803, fue adquirida de la colección de cepas proveniente de la Universidad de Texas (Austin, Texas, USA); se cultivó en medio Bold Basal, cuya composición en g/l es: NaNO₃ (2,94 X 10^-3), MgSO₄.7H₂O (3,04 X 10^-4) NaCl (4,28 X 10^-4), K₂HPO₄ (4,31 X 10^-4), KH₂PO⁴ (1,29 X 10^-3), CaCl₂.2H₂O (1,70 X 10^-4) y micronutrientes (g/l) ZnSO₄.7H₂O (3,07 X 10^{- 5}), MnCl₂.4H₂O (7,28 X 10^-6), MoO₃ (4,93 X 10^-6), CuSO₄.5H₂O (6,29 X 10^-6), Co(NO₃)₂.6H₂O (1,68 X 10^-6), H₃BO₃ (1,85 X 10^-4), EDTA (1,71 X 10^-4), KOH (5,53 X 10^-4), FeSO₄.7H₂O (1,79 X 10^-5). Como reactores se usaron botellas plásticas transparentes de 2,5l con diámetro interno de 14cm y 35cm altura con un volumen del cultivo de 2l. Los reactores se acoplaron a un sistema de aireación por burbujeo para la inyección de aire y CO₂. Con este sistema se buscó mejorar la homogeneidad de todo el cultivo.

Relación carbono/nitrógeno
Con el fin de mejorar la productividad de biomasa, se probaron diferentes relaciones carbono/nitrógeno en condiciones autotróficas. Se utilizaron flujos continuos de CO₂ y diferentes concentraciones de nitrato de sodio (Tabla 1). La inyección continua de CO₂ fue proporcionada por una bala de CO₂.

Cada uno de los tratamiento se realizó por triplicado sometidos a ciclos de 12:12 horas de luz: oscuridad y a una temperatura de 23±1°C; todos los experimentos tuvieron un tiempo de cultivo de 5 días.

Cuantificación de biomasa
Para las mediciones de concentración de biomasa, se tomó una muestra de 6 ml de cada cultivo. Posteriormente se diluyó a una relación muestra:agua destilada de 1:8. Luego se utilizó un espectrofotómetro (Spectroquant^® Pharo 300) con el cual se midió la densidad óptica de cada muestra a una longitud de onda de 500nm (los valores típicos de medición están entre 0,1 - 0,9). La densidad óptica (DO) fue correlacionada con la cantidad de biomasa (g/l, C_B) de acuerdo con:

Concentración de clorofila total
Para la cuantificación de clorofila total, se tomaron alícuotas de 10ml de cada fotobioreactor, la cual fue centrifugada a 3400rpm durante 7min (Centrifuga PowerSpin™ MX). Luego se extrajo el sobrenadante con el fin de eliminar el medio presente. El pellet (biomasa resultante) fue resuspendido en 3ml de etanol al 99%v. La mezcla se llevó a calentamiento en baño maría durante 5min. Luego de un posterior enfriamiento se agregaron 2ml adicionales de etanol y se centrifugó por 1min a 2000rpm. La concentración de clorofila en el sobrenadante se calculó leyendo la absorbancia (A) del pigmento en el espectrofotómetro a 650 y 665nm. La relación de la cantidad de clorofila (a+b) en el sobrenadante C_a+b (mg/l) con la densidad óptica fue correlacionada de acuerdo con la ecuación de Becker [52].

Análisis estadístico
Se estudió la influencia del la relación C/N en la productividad de biomasa y cantidad de clorofila (a+b) de C. vulgaris en cultivos autotróficos, mediante el análisis de 2 diseños factoriales de 2 factores utilizando el software Demo-MINITAB. Los factores a estudiar fueron: %CO₂ con 2 niveles (2,3 y 3,8%v) y concentración de NaNO₃ con 4 niveles (0,59mM; 1,18mM; 1,77mM; 2,35mM).

Para cada uno de los diferentes tratamientos, no se encontró inhibición aparente tanto por las concentraciones de CO₂ utilizadas como las de NaNO₃ (Figuras 1 y 2), Para el caso de 2,3%v de CO₂ (Figura 1), no se presentaron etapas de adaptación, lo cual permitó un rápido crecimiento desde el primer día de cultivo, estos resultados son consistentes con los obtenidos por Fan et al. [53], donde un cambio en las condiciones del cultivo microalgal acarreará cambios en las fases de adaptación y crecimiento exponencial. Dentro de los resultados de cantidad de biomasa para la concentración de 2,3%v, el tratamiento con 0,59mM de NaNO₃ produjo 1,416g/l; cultivos con concentraciones de 0,59 y 1,18mM de NaNO₃ tuvieron un comportamiento similar, aunque sus velocidades específicas de crecimiento máximo (μ_MAX) fueron diferentes (Tabla 2). Los cultivos con concentraciones de 1,76 y 2,35mM de NaNO₃ presentaron fases de adaptación de 2 y 3 respectivamente, después de los cuales iniciaron su fase de crecimiento exponencial con mayores μ_MAX.

En la Figura 2 se observa el comportamiento para la concentración de 3,8%v de CO₂, el cual obtuvo en general una mayor velocidad de crecimiento en comparación con los de 2,3%v; la mayor μ_MAX se encontró para el tratamiento con una concentración inicial de 1,18mM de NaNO₃ (Tabla 3), generando 2,199g/L de biomasa. Cada cultivo tuvo un determinado día donde su crecimiento comenzó a ser exponencial, siendo un factor en la producción final de cada cultivo.

La producción de clorofila para los cultivos con una concentración de 2,3% v de CO₂ presentó un estado de adaptación (Figura 3), siendo más largo para los cultivos con concentraciones iniciales de 1,18mM y 2,3 de NaNO₃. Sin embargo, todos los cultivos aumentaron su cantidad de clorofila hasta el quinto día, esto se debe a que en el medio hay suficiente nitrógeno para suplir las necesidades fotosintéticas del alga. La mayor producción de clorofila se alcanzó en el cultivo con una concentración inicial de nitrógeno de 1,18mM.

A diferencia de los cultivos con 2,3%v de CO₂, los cultivos con 3,8% tuvieron una fase de baja productividad durante los tres primeros días, esto ocurre debido al aumento en la cantidad de CO₂ suministrado; sin embargo, el alga necesita estabilizarse a sus nuevas condiciones para que su metabolismo funciones correctamente [19]. Después del tercer día se observó un aumento en las tasas fotosintéticas de todos los experimentos con respecto a los días anteriores, indicando la adaptación a las condiciones (Figura 4). El cultivo con una concentración inicial de nitrógeno de 0,59mM de NaNO₃ presentó una caída en su concentración de clorofila en el último día de experimentación, esto puede deberse a la falta de nitrógeno en el medio, ya que según Rodríguez-González AM & Serrano-Luna FA [54], hasta el 90% del nitrógeno del medio de cultivo es consumido durante los cinco primeros días de cultivo, por lo cual el alga aprovecha las reservas de este nutriente (principalmente en forma de proteínas y clorofila) para así mantener sus actividades metabólicas [19]. En este caso específico, el cultivo pasará de un estado autotrófico (donde la principal fuente de carbono proviene del CO₂), a un estado heterotrófico, en el cual no dependerá de la clorofila, sino consumirá otras fuentes de carbono (en este caso carbohidratos extracelulares que la misma alga hubiese secretado en las primeras etapas de su crecimiento [55].

En la Figura 5 se presenta la productividad para los dos tratamientos de CO₂, donde es posible destacar el aumento significativo en la productividad para cada uno de estos en comparación con el control, aunque el nitrógeno se considera como un factor determinante en la producción de biomasa [56] según Flynn [41]. El estrés generado por déficit de este nutriente afecta significativamente el crecimiento celular y el consumo de la fuente de carbono; esto se ve soportado con los datos obtenidos, donde al regular la relación entre el carbono y nitrógeno suministrado en el medio de cultivo es posible incrementar no sólo el consumo de la fuente de carbono (en este caso mejorar el secuestro de CO₂ por parte de la microalga), sino a la vez aumentar la cantidad de biomasa. Otra explicación es debido a la fuerte relación entre la asimilación del nitrógeno y el metabolismo del CO₂ [46,47].

Debido a la obtención de resultados similares en la productividad de biomasa (0,4 y 0,44g/l.día) para los experimentos con las menores concentraciones de nitrato (0,59 y 1,18mM) y 3,8%v de CO₂, se realizó un nuevo experimento con una concentración intermedia de nitrato (0,88mM); la productividad obtenida de este nuevo tratamiento fue de 0,43g/l.día (Figura 6), el cual es un valor intermedio entre los dos tratamientos originales. Este resultado confirma la existencia de un rango en la concentración inicial de nitrógeno que maximiza la producción de biomasa (entre 0,4 a 0,44g/l.día).

Para el análisis estadístico se realizaron 2 diseños factoriales de 2 factores con el fin de analizar el efecto que tienen los factores %CO₂, concentración de NaNO₃ y su interacción en las variables de respuesta Productividad (Q) y Clorofila (C_a+b).

Primero se analizó la influencia de los 2 factores en cada uno de los valores de productividad (Q) de biomasa de C. vulgaris.
Se aplicó una serie de pruebas de normalidad y un test de homogeneidad de varianza del efecto carbono/nitrógeno sobre la productividad para evaluar la normalidad del conjunto de datos a analizar. Utilizando la prueba de Kolmogorov- Smirnov, se puedo concluir que los datos de productividad presentan una distribución normal y homogeneidad en las varianzas (p>0,05). Por otro lado, los resultados de la prueba de análisis de varianza (ANOVA) permitieron inferir que las variaciones del %CO₂ y de la concentración NaNO₃ tienen efectos significativos en la Q (p<0,05) obtenida en los cultivos modificados de C. vulgaris, esto nos permite inferir que la relación entre el concentración de nitrógeno y carbono influye positivamente en el mejoramiento de la biomasa.

La regulación de la cantidad tanto de carbono como de nitrógeno suministrado afecta positivamente la producción de biomasa, donde bajas concentraciones de la fuente de nitrógeno (menos de 1,18mM) y altas concentraciones de carbono (3,8%v de CO₂) mejoran hasta dos veces la productividad total de biomasa (de 0,2 a 0,44g/l.día). Otro fenómeno a resaltar es la no existencia de óptimos locales en la producción de biomasa, ya que con valores de hasta 0,59mM de NaNO₃, es posible obtener altos valores de productividad. Estos resultados representan un avance importante en la producción de cultivos microalgales, ya que abre las posibilidades para mejorar la producción total de biomasa mientras se reducen costos operacionales y tiempos de producción, además permite desarrollar estrategias para acoplar la producción de diferentes metabolitos (ya sea para la obtención de biocombustibles como biodiesel o otros elementos) con el secuestro de CO₂.

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