Bibiana Zapata1, Camilo Durán2, Elena Stashenko2,
Liliana Betancur-Galvis1, Ana Cecilia Mesa-Arango1
1. Grupo de Investigación Dermatológica, GRID Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia, Medellín
2. Centro de Investigación en Biomoléculas, CIBIMOL. Universidad Industrial de Santander.
Correspondencia: Ana Cecilia Mesa Arango. Bact, MSc. Grupo de Investigación Dermatológica, Facultad de Medicina,
Universidad de Antioquia, Medellín. Carrera 51D # 62-29 Laboratorio 283, Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia,
Medellín, Colombia. Teléfono: + 574 219 60 59 Fax: + 574 219 60 51.
E-mail: amesa@medicina.udea.edu.co
Recibido: 10 de octubre de 2009 - Aceptado: 20 de diciembre de 2009
RESUMEN
Introducción: Candida spp. y Aspergillus spp. son causa importante de infecciones a nivel mundial. Considerando la resistencia de estos patógenos a algunos de los antimicóticos disponibles, es necesaria la búsqueda de nuevos agentes antimicóticos. Diferentes aceites esenciales y extractos de plantas han mostrado actividad antimicótica in vitro. El objetivo de este estudio fue evaluar la actividad antimicótica, citotóxica y la composición química de aceites esenciales de la familia Labiatae. Materiales y métodos: Se evaluó la actividad antimicótica de 22 aceites de plantas de la familia Labiatae contra C. parapsilosis ATCC 22019, C. krusei ATCC 6258, A. flavus ATCC 204304 y A. fumigatus ATCC 204305, siguiendo las técnicas estándar EUCAST y CLSI M38-A para levaduras y hongos filamentosos, respectivamente. Adicionalmente la actividad citotóxica se evaluó en la línea celular Vero mediante la técnica colorimétrica del MTT. La caracterización de los aceites esenciales se llevó a cabo por cromatografía de gases acoplada a masas. Resultados: El aceite esencial mas activo fue el de Minthostachys mollis frente a todas las cepas evaluadas con rangos concentraciones mínimas inhibitorias (CMIs) entre 250 y 375 μg/mL. El aceite de la planta Hyptis mutabilis mostró actividad frente a A. fumigatus (CMI = 396,8 μg/mL). Estos aceites esenciales no fueron citotóxicos sobre las células Vero. Los componentes principales de los aceites de las plantas M. mollis y H. mutabillis fueron epóxido de cis-piperitona y 1,8-cineol, respectivamente. Conclusiones: Los aceites esenciales de las plantas M. mollis y H. mutabillis mostraron actividad antimicótica y no fueron citotóxicos en células Vero. Salud UIS 2009; 41: 223-230
Palabras Claves: Labiatae, citotoxicidad, actividad antimicótica, Aspergillus spp, Candida spp
Antifungal activity, cytotoxicity and composition
of essential oils from Labiatae family plants
ABSTRACT
Introduction: Aspergillus spp. and Candida spp. are important cause of infections worldwide. Considering the resistance of these pathogens to some antifungal agents, there is greater need to search for new antifungal agents. Many extracts and essential oils isolated from plants have shown to exert antifungal effects in vitro. The aim of this study was to evaluate the antifungal, cytotoxic effect, and chemical composition of essential oils of family Labiatae. Materials and methods: Antifungal activity of twenty two essential oils from Labiatae family was evaluated against C. parapsilosis ATCC 22019, C. krusei ATCC 6258, A. flavus ATCC 204304 y A. fumigatus ATCC 204305, following EUCAST and M38-A standard protocols for yeast and filamentous fungi, respectively. Additionally, cytotoxic activity was evaluated on Vero cell line by colorimetric assay MTT. Essential oils was characterized by gas chromatography coupled to mass spectrometry. Results: The most active oil with all strains was obtained of Minthostachys mollis (MIC range 250 - 375 μg/mL). The essential oil from Hyptis mutabillis showed activity against A. fumigatus (GM-MIC = 396.8 μg/mL). These essential oils were not cytotoxic on Vero cells. The major components of essential oils from M. mollis and H. mutabillis were cis-piperitone epoxide and 1,8-cineol, respectively. Conclusions: Essential oils of H. mutabillis and M. mollis showed antifungal activity and they were not cytotoxic on Vero cells. Salud UIS 2009; 41: 223-230.
Keywords: Labiatae, cytotoxicity, antifungal activity, Aspergillus spp, Candida spp
INTRODUCCIÓN
Especies de Candida y Aspergillus han sido implicadas en una gran variedad de infecciones que comprende desde formas superficiales a invasivas1-3. Las ultimas, son causa importante de morbilidad y mortalidad en pacientes con trasplante de órganos, malignidades hematológicas y enfermedades inmunosupresoras, entre otros1. Adicionalmente, especies de ambos géneros, tienen la capacidad de formar biopelículas en catéteres4-6. Además, Aspergillus es uno de los contaminantes de ambientes hospitalarios, por lo que constituye un riesgo para pacientes hospitalizados7.
El tratamiento de las infecciones micóticas es limitado tanto por la toxicidad de Anfotericina B8, la resistencia de algunas especies de Aspergillus y Candida a antimicóticos como Anfotericina B, Itraconazol, Fluconazol y Voriconazol9-10, como por el alto costo de los tratamientos 3. Lo anterior ha estimulado la búsqueda de nuevas moléculas con potencial antifúngico en productos obtenidos de diferentes plantas11.
En Colombia se han identificado aproximadamente 23 géneros y cerca de 205 especies de plantas de la familia Labiatae12. La infusión de las hojas de las plantas de esta familia como Hyptis capitata y Salvia officinalis se usan en la medicina tradicional colombiana, como antisépticas, anti-inflamatorias, antiespasmódicas y analgésicos13.
Diferentes estudios han mostrado actividad antimicótica in vitro de aceites esenciales de plantas de la familia Labiatae como Melissa officinalis, Hyptis ovalifolia, Mentha piperita y Ocimum basilicum contra aislados clínicos de C. albicans, Trichophyton rubrum, T. mentagrophytes y Microsporum canis14-17. Sin embargo, la actividad sobre especies de hongos ambientales de importancia medica como Aspergillus fumigatus y A. flavus y otras especies de Candida no albicans, no se conoce. Considerando lo anterior, el objetivo de este estudio fue evaluar la actividad de aceites esenciales derivados de plantas de la familia Labiatae recolectadas en diferentes regiones de Colombia, contra cepas de Candida y Aspergillus así como la actividad citotóxica en células Vero.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal y obtención de aceites esenciales
Para la obtención de los aceites, se recolectaron 22 plantas de la familia Labiatae en cuatro departamentos de Colombia (Santander, Choco, Pasto y el Tolima). La identificación taxonómica del material vegetal se llevó a cabo en el Instituto de Ciencias Naturales de la Universidad Nacional de Colombia (Bogotá), por el Doctor José Luis Fernández. Los pliegos testigo de cada planta se encuentran depositados como muestras permanentes en el Herbario Nacional de Colombia. Los aceites esenciales se extrajeron por medio de la técnica de hidrodestilación asistida por radiación con microondas (MWHD), descrita previamente18. Para los ensayos, se prepararon soluciones concentradas a 20 mg/mL en dimetil sulfóxido (DMSO). La caracterización de los aceites esenciales que mostraron actividad antimicótica, se llevó a cabo por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS)18.
Actividad antimicótica
La actividad antimicótica se evaluó de acuerdo a la técnica de susceptibilidad antimicótica propuesta por el European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST)19 para las levaduras y por el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M38-A20 para hongos filamentosos. Se incluyeron las cepas C. parapsilosis ATCC 22019, C. krusei ATCC 6258, A. flavus ATCC 204304 y A. fumigatus ATCC 204305. Los aceites esenciales se evaluaron a concentraciones en el rango de 31,25 - 500 μg/mL. Los fármacos Itraconazol y Anfotericina B (Sigma-Adrich, Co, MO, USA) se emplearon como controles de las técnicas en el rango de concentración de 0,031 - 16 mg/mL. Además se incluyó un control de crecimiento en cada experimento. Las concentraciones mínimas inhibitorias (CMIs) con las levaduras se determinaron por espectrofotometría y correspondieron a las mínimas concentraciones donde se observó inhibición del 50% del crecimiento o más respecto al control (100%). Las CMIs de los hongos filamentosos se determinaron por lectura visual y correspondieron a la mínima concentración de cada aceite que inhibió el 100% del crecimiento.
Actividad citotóxica
La citotoxicidad se evaluó en células de riñón de mono verde africano (Vero ATCC CCL-81) mediante la técnica fotocolorimétrica del MTT (3-(4,5-Dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolium bromuro) con algunas modificaciones21. Las células se mantuvieron en medio mínimo esencial (MEM) suplementado con suero bovino fetal (10%), aminoácidos no esenciales (1%), L-glutamina 1%, vitaminas 1%, Penicilina 100 U/mL, Estreptomicina 100 μg/mL, Neomicina 100 μg/mL, Hepes 1M y bicarbonato al 7%.
Las células se cultivaron a una densidad de 1.4 x105/mL en placas de 96 pozos y se incubaron durante 24h a 37°C con 5% de CO2 en atmosfera húmeda. Posteriormente, se agregaron 100 μL de los aceites a concentraciones finales en un rango de 25 - 200 μg/mL. Las placas se incubaron por un periodo adicional de 48h a 37°C y finalmente se realizó lectura espectrofotométrica a 570 nm para la determinación de la concentración que inhibió el crecimiento o mató el 50% de las células (CC50).
Análisis de datos
Los ensayos de la actividad antimicótica, se realizaron por duplicado en tres momentos diferentes para cada hongo. Los valores de las CMIs se expresaron como medias geométricas (MG-CMI). Los ensayos de citotoxicidad se realizaron por cuadruplicado y las CC50 se expresaron como CC50 ± desviación estándar (CC50 ± DS). Las CC50 se obtuvieron mediante análisis de regresión lineal simple con el paquete estadístico R (Development Core Team, Vienna, Austria, 2008). Se aceptaron las regresiones con un coeficiente de correlación múltiple al cuadrado (R2) mayor de 0,7 y se realizó un análisis de residuales para determinar si el efecto de los aceites era dosis dependiente.
RESULTADOS
En este estudio se evaluó la actividad antimicótica y citotóxica de 24 aceites esenciales provenientes de diferentes géneros de la familia Labiatae. En la Tabla 1 se presentan los nombres científicos y números de voucher de las 22 plantas de donde se obtuvieron los aceites, así como las MG-CMI y los valores de CC50 de los aceites
A la fecha no existe un consenso sobre los criterios para definir actividad antimicótica de productos naturales. Holetz y col (2002)22 sugirieron clasificar la actividad antimicótica de productos naturales con base en el valor de la CMI de la siguiente manera: (CMI ≤100 μg/mL) buena, (CMI 100-500 μg/mL) moderada y CMI (500-1000 μg/mL) débil. Con base en lo anterior, el aceite de la planta M. mollis mostró actividad moderada contra C. krusei ATCC 6258, C. parapsilosis ATCC 22019, A. flavus ATCC 204304 y A. fumigatus ATCC 204305 con valores de CMI de 250, 375, 314,9 y 314,9 μg/mL, respectivamente. Asimismo, el aceite de la planta H. mutabilis 01 fue moderadamente activo con A. fumigatus (CMI =396,8 μg/mL. Los aceites de las plantas L. betonicifolia y L. bullata fueron moderadamente activos (CMIs = 500 μg/mL) con C. krusei ATCC 6258 y A. fumigatus ATCC 204305 (Tabla 1). Finalmente, la actividad antimicótica de los demás aceites fue débil.
Las MG-CMIs de los fármacos Itraconazol y Anfotericina B con C. krusei (CMIs = 0,125 μg/mL y 0,630 μg/mL), C. parapsilosis (CMIs = 0,099 μg/mL y 0,630 μg/mL), A. flavus (CMIs = 0,198 μg/mL y 1,260 μg/mL) y A. fumigatus (CMIs = 0,157 μg/mL y 1,260 μg/mL), respectivamente, se encontraron dentro de los rangos establecidos por las técnicas de referencia.
Según el Instituto Nacional de Cáncer de Estados Unidos, un extracto es citotóxico si la CC50 < 30 μg/mL23. De acuerdo a este criterio, 20 de los aceites esenciales evaluados no fueron citotóxicos sobre células Vero (rangos de CC50 entre 31,2 y 200 μg/mL). Los demás aceites: O. campechianum 02, M. mollis 02 y H. mutabilis 02, fueron citotóxicos (Tabla 1).
En la Tabla 2 se muestra la composición los aceites esenciales en los que se encontró la mayor actividad. En el aceite de la planta M. mollis se identificaron 33 componentes y los mayoritarios fueron epóxido de cis-piperitona (29,9%) y óxido de piperitenona (25,6%). Los componente mayoritarios del aceite de la planta H. mutabillis correspondieron a 1,8-cineol (17,4%) y fenchona (17,1%), de 41 identificados
DISCUSIÓN
El uso medicinal de algunas de las plantas de la familia Labiatae es permitido por parte del Instituto Nacional de Medicamentos y Alimentos de Colombia (INVIMA), entre ellas S. officinalis como antiflatulento13.
El aceite de la planta M. mollis 02 fue el más activo con C. krusei (CMI = 250 μg/mL). Es posible que la actividad antimicótica del aceite esté asociada a su componente mayoritario (epóxido de cis-piperitona). En la literatura revisada, no se encontraron reportes de actividad antimicótica de epóxido de cis-piperitona. Saleh y col (2006) demostraron que los componentes mayoritarios del aceite de Artemisia herba, carvona y peperitona, fueron los responsables de la actividad contra Penicillium citrinum y Mucor rouxii 24.
La importancia de encontrar compuestos activos contra C. krusei radica en que esta levadura es intrínsecamente resistente a Fluconazol y con baja sensibilidad a otros azoles y a Anfotericina B25.
Diferentes estudios in vitro han mostrado la actividad antimicótica de aceites esenciales de plantas de la familia Labiatae empleadas en la medicina tradicional14-17. La infusión de las hojas de la planta M. piperita (Labiatae) se empleada en la medicina tradicional colombiana como antiséptico, antiespasmódico y para el tratamiento del reumatismo13. Iscan y col (2002)14, encontraron actividad en el aceite de la planta M. piperita contra C. albicans (rango CMI =312 y 2500 μg/mL) con una técnica de difusión en agar. En general, las CMI de los aceites evaluados en este estudio fueron inferiores a los valores encontrados por Iscan y col (2002)14.
Otra planta de la familia Labiatae utilizada en la medicina tradicional colombiana como antidiarréico13 es H. capitata. La actividad antimicótica de plantas de otra especie de este género, H. ovalifolia, se ha demostrado con hongos de importancia medica como M. canis, M. gypseum, T. rubrum y T. mentagrophytes15. Nuestro aporte en este estudio fue demostrar la actividad del aceite de H. mutabilis contra el hongo ambiental A. fumigatus, importante por su capacidad para causar infección en el hombre, principalmente en ambientes hospitalarios donde puede ocasionar infecciones nosocomiales7.
En la medicina tradicional de Perú, la planta M. mollis se emplea para el tratamiento de infecciones del tracto digestivo y como sedante26; sin embargo, la actividad antimicótica y la citotoxicidad de los aceites esenciales de esta planta aun no se ha evaluado. El aceite de esta planta fue activo contra las cuatro cepas evaluadas, y adicionalmente su citotoxicidad fue baja sobre células Vero.
En este estudio no se encontró actividad en los aceites de las plantas del genero Ocimum, sin embargo en un trabajo previo17, se encontró actividad del aceite de O. basilicum contra otros hongos de importancia médica como C. albicans, T. mentagrophytes, T. tonsurans, T. rubrum, M. canis y Epidermophyton floccosum.
La diferencia en la actividad antimicótica entre los diferentes estudios con aceites de plantas de los mismos géneros y/ o especies podrían estar asociados a las técnicas usadas en cada estudio para evaluar la susceptibilidad antimicótica, a la diferencias estructurales que existen entre los diferentes géneros y especies de hongos evaluados27 y/o a la composición de los aceites esenciales.
Fenchona es una cetona en la que se ha demostrado actividad antimicótica contra Rhizoctonia solani. Nosotros encontramos esta molécula como componente mayoritario del aceite esencial de la planta H. mutabillis. Con base en lo anterior, es posible pensar que la actividad del aceite de H. mutabillis contra A. fumigatus esté dada por fenchona.
Este es el primer estudio en Colombia en el que se demuestra la actividad del aceite esencial de la planta H. mutabillis contra A. fumigatus y del aceite M. mollis no solo contra este hongo sino contra A. flavus, C. krusei y C. parapsilosis. Los resultados obtenidos son importantes si se tiene presente que las especies de Candida y Aspergillus tienen capacidad de formar biopeliculas en catéteres, convirtiéndose en una amenaza para una infección nosocomial 4-5.
AGRADECIMIENTOS
Los resultados de este artículo se derivan del proyecto RC 432-2004 financiado por el Instituto colombiano para el desarrollo de la ciencia y la tecnología-COLCIENCIAS, Bogotá, Colombia.
CONFLICTOS DE INTERESES
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Ana Cecilia Mesa Arango certifica que: El manuscrito representa un trabajo válido, y que ni este manuscrito, ni otro con un contenido sustancial similar, ha sido publicado bajo mi autoría o está siendo considerado para su publicación en otro lugar. No tiene intereses financieros en relación con este manuscrito. Todo el apoyo material y de financiación para este trabajo está claramente expresado en el manuscrito.
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