DOI: http://dx.doi.org/10.18273/revsal.v49n4-2017004
Artículo de Investigación e Innovación
Estandarización de
ELISA para el diagnóstico de fasciolosis bovina, ovina y humana
Standardization of
ELISA for the diagnosis of bovine, ovine and human fasciolosis
Raúl Sierra Balcárcel 1
Ruth Aralí Martínez Vega 1
Reynaldo Gutiérrez Marín 1
Cecilia Dolores Colmenares 1
Nelson Uribe Delgado 1
1 Universidad Industrial de Santander.
Bucaramanga, Colombia.
1 Universidad de Pamplona. Pamplona,
Norte de Santander.
1 Universidad Central de Venezuela.
Caracas, Venezuela.
Correspondencia:
Nelson Uribe Delgado. Dirección: Carrea 32 29-31. Correo electrónico: nelurdel@uis.edu.co . Teléfono : +57 320 4456726
Recibido: 20/06/2017
Aprobado: 06/09/2017
Publicado online: 30/09/2017
RESUMEN
Introducción: La
fasciolosis representa un grave problema para el sector pecuario y la salud
humana en muchos países. En Colombia, afecta principalmente al ganado bovino y
ovino, con escasos reportes en humanos.
Objetivo: Estandarizar
un Ensayo de Inmunoadsorción Enzimática para bovinos, ovinos y humanos como
herramienta de tamizaje de fasciolosis.
Metodología: Se
utilizaron 50 muestras de bovinos, 50 de ovinos y 39 de humanos con diagnóstico
de fasciolosis confirmado por serología y examen de materia fecal. Se
utilizaron cuatro presentaciones del antígeno excretor-secretor de Fasciola hepatica. Se calcularon la
sensibilidad, la especificidad y la concordancia.
Resultados: La
sensibilidad del ELISA en humanos, ovinos y bovinos fue de 100% y la
especificidad fue de 97%, 85,2% y 96,2%, respectivamente. El coeficiente Kappa
de Cohen fue superior a 0,8 en las tres especies.
Conclusiones: La
prueba de ELISA estandarizada para el diagnóstico de la fasciolosis humana,
ovina y bovina demostró una excelente sensibilidad y buena especificidad. Se
propone realizar la validación a mayor escala para su posterior uso como
herramienta en el tamizaje de esta parasitosis.
Palabras clave: Ensayo de
Inmunoadsorción Enzimática, diagnóstico, fascioliasis, Fasciola hepatica, Estándares de Referencia, humanos, ovinos,
bovinos.
ABSTRACT
Introduction: Fascioliasis
represents a serious problem for livestock production and human health in the
world. In Colombia, it mainly affects bovine and ovine cattle, with few cases
reported in humans.
Objective: To
standardize an Enzyme-Linked ImmunoSorbent test (ELISA) in bovine, ovine, and
human individuals as a screening tool of fascioliasis.
Methods: 50 bovine, 50 ovine
and 39 human samples with fascioliasis confirmed by serology and stool test
were used. Sensitivity, specificity and concordance were calculated.
Results: Sensitivity of the
ELISA in humans, bovine and ovine cattle was 100 % and specificity was 97%,
85.2% and 96.2%, respectively. Cohen´s Kappa coefficient was >0.8 in all
groups.
Conclusions:
Standardized ELISA test for bovine, ovine and human fascioliasis exhibited an
excellent sensitivity and good specificity. It is proposed to carry out a
large-scale validation for its ulterior use as a screening tool for the
diagnosis of this parasitic infection.
Keywords: Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay, diagnosis, fascioliasis, Fasciola hepatica, standardization, humans, sheep, cattle.
INTRODUCCIÓN
La fasciolosis es una
zoonosis cosmopolita, considerada como una de las enfermedades parasitarias más
importantes de los rumiantes domésticos, que además afecta a gran cantidad de
animales herbívoros y omnívoros, ocasionalmente al hombre y raramente aves(1). Se caracteriza por un
proceso inflamatorio del hígado y el conducto biliar, frecuentemente crónico y
relacionado con trastornos de asimilación de los nutrientes. El agente
etiológico en Colombia y otros países de América, África y Europa es Fasciola hepatica, mientras que Fasciola gigantica lo es en países de
Asia(2).
La distribución
geográfica del parásito depende de la presencia de los moluscos hospedadores
intermediarios pertenecientes a la familia Lymnaeidae,
los cuales han sido reportados en los más diversos pisos térmicos, entre 0 y
más de 4.000 msnm. Así mismo, F. hepatica
es el único parásito capaz de originar zonas hiperendémicas humanas desde
el nivel del mar, como en la provincia de Gilán en Irán, hasta altitudes
superiores a 3.800 msnm en altiplanos y valles de Bolivia y Perú. No hay otro
helminto que presente tan amplia distribución altitudinal y latitudinal como
este trematodo(3).
La fasciolosis
ocasiona un grave problema socioeconómico para el sector pecuario mundial, con
cifras superiores a 600 millones de animales infectados y presentándose en
algunas regiones prevalencias entre 25% y 100% en ganado vacuno y búfalos.
Representa un significativo impacto económico principalmente en ovinos y
bovinos con pérdidas anuales calculadas en US 3.000 millones(4). En
Colombia en 1996 se estimaron las pérdidas en $12.500 millones(5).
Sin embargo, este valor debe ser nuevamente calculado ya que han sido descritas
nuevas zonas endémicas de fasciolosis después de ese año.
Esta parasitosis en
Colombia y otros países recibe mayor atención en el sector pecuario por la alta
prevalencia e impacto económico que presenta, si se compara con el interés que
despierta en el ámbito de la salud humana. No obstante, en las dos últimas
décadas se ha calificado como emergente y reemergente en humanos, presentándose
en los cinco continentes, en diferentes latitudes y altitudes, por lo que la
Organización Mundial de la Salud (OMS) ha lanzado una iniciativa de control,
considerándola un problema de salud pública mundial. La infección en humanos se
ha incrementado en casos y número de países afectados. En 1995 la OMS estimó en
2,4 millones las personas infectadas y 180 millones las que están en riesgo de
adquirirla; sin embargo, otras fuentes plantean cifras superiores a 17 millones
de personas las que sufren la enfermedad(6,7). Estos datos pueden no
ser reales ya que no se cuenta con información actualizada que dimensione con
precisión la prevalencia mundial.
En algunas regiones
de economía campesina la concurrencia de diferentes especies de explotación
pecuaria como bovinos y ovinos es frecuente, y se constituye en un factor que
facilita la endemicidad de la parasitosis animal. Así pues, se ha demostrado
que en la contaminación continua de los pastos, los ovinos con infección
crónica juegan un papel importante en el mantenimiento y diseminación del
parásito, ya que un solo ovino puede eliminar entre 2,5 a 3,5 millones de
huevos en un día, aumentando la probabilidad de infección de otros herbívoros
susceptibles y de los humanos que viven en estas regiones(7,8). A
pesar de lo anterior, los pequeños y medianos productores de los países del
tercer mundo no utilizan las herramientas diagnósticas como parte de las buenas
prácticas en el manejo de los animales debido a cuestiones de tipo cultural,
costos o dificultad para acceder a ellas(9).
Considerando el
problema que esta parasitosis significa para la salud humana y animal, es
esencial contar con técnicas de laboratorio que ofrezcan buena
sensibilidad-especificidad, bajo costo, alto rendimiento y reproducibilidad.
El diagnóstico de
rutina de la fasciolosis animal se hace utilizando el examen coprológico,
principalmente mediante la técnica de Dennis para la búsqueda de huevos, lo
cual es un hallazgo de gran utilidad pues informa de una infección o enfermedad
actual. Sin embargo, estas técnicas
presentan algunas desventajas como la baja sensibilidad que depende, entre
otras razones, del momento de inicio y la intermitencia en la ovoposición y de
la carga parasitaria. Además, la observación de los huevos requiere
adiestramiento para su correcta identificación y para no confundirlos con los
huevos de paramphistomidos. Una dificultad adicional, es que sólo se encuentran
huevos después de 12 semanas post-infección, cuando el daño hepático es
avanzado.
La respuesta inmune en la fase de invasión y migración del
parásito en los hospedadores definitivos es principalmente de tipo Th2, con
altos títulos de IgG detectables desde la segunda semana post-infección y por
largo tiempo, sirviendo como marcador de la infección aguda y crónica y excelente
isotipo a determinar mediante ELISA(10,11,12).
Estas son algunas de
las razones por lo que diversos grupos de investigación en el mundo han
estandarizado esta técnica para el diagnóstico de la fasciolosis en humanos y
animales. Para ello se vienen implementando diversas variantes de la
metodología que buscan el mayor rendimiento de la prueba, para la cual se ha
utilizado una diversidad de antígenos como: extractos somáticos totales,
metabólicos, recombinantes y fracciones purificadas(13,14,15,16,17,18,19,20,21).
Otra metodología empleada en el diagnóstico de la fasciolosis es el Western blot o
inmunoelectrotransferencia (EITB), que permite aumentar la especificidad además
de evaluar las proteínas inmunodominates(15,16,17,18,19) que pueden
ser empleadas como marcadores específicos en pruebas serológicas(6);
sin embargo, este método no es empleado en la mayoría de laboratorios en los
cuales se realiza diagnóstico de la patología, ya que no cuenta con estándares
que permitan su rápida masificación.
El antígeno excretor
secretor de Fasciola hepatica (AgE/
SFh) juega un importante papel en la estimulación de la respuesta de
anticuerpos detectada desde la segunda semana postinfección y antes de la
aparición de la sintomatología y de los hallazgos parasitológicos(10,11).
Este antígeno ha sido utilizado en diferentes presentaciones y técnicas de
inmunodiagnóstico con buenos resultados de sensibilidad (S) y especificidad
(E), valores que oscilan entre el 70 y 100% para las dos probabilidades
diagnósticas(14,15,16,19,20,21).
Como alternativa a la
baja sensibilidad del examen coprológico, y respondiendo a la necesidad de
contar con una técnica de diagnóstico versátil, este artículo presenta los
resultados de la estandarización de un ELISA para fasciolosis en bovinos, ovinos
y humanos utilizando el antígeno AgE/SFh en las condiciones locales,
comparándola con una técnica desarrollada en la Universidad Central de
Venezuela(21). La estandarización de la misma se efectuó con el
propósito de que sirva como herramienta de tamizaje a nivel nacional.
MATERIALES Y MÉTODOS
Obtención del Antígeno. Para
obtener el antígeno se recolectaron vermes de hígados de bovinos infectados con
F. hepatica proporcionados por la
planta de sacrificio “El Vijagual” de la ciudad de Bucaramanga. Los parásitos
fueron recogidos en solución salina 0,9% y mantenidos a 37°C durante el
traslado al laboratorio. El AgE/SFh se obtuvo incubando los parásitos
individualmente en 1mL de medio RPMI 1640 durante 30 horas, con
recambio cada seis horas, y bajo una un atmósfera de 5% de CO2. Una
vez extraído el medio, se añadió un coctel de inhibidores de proteasas (PMFS
1mM, EDTA 0,5M) y penicilina (10.000 UI/mL); posteriormente se liofilizó y
reconstituyó en PBS. A este antígeno se llamó Preparado 1 (P1). Con el objetivo
de obtener y probar otros preparados del antígeno se hicieron dos
modificaciones: La primera consistió en adicionar Ácido Tricloro-Acético (20%)
al producto reconstituido después de ser liofilizado (P2) y en la segunda
modificación, el producto reconstituido se pasó por membranas Amicon® Y100 y
Y50 para obtener fracciones proteicas de diferente peso molecular. A los
productos retenidos se le denominó R100 y R50, respectivamente. Los cuatro
antígenos fueron analizados utilizando PAGE al 12% para comprobar la integridad
de las proteínas. La concentración de proteínas se calculó utilizando el método
de Bradford (Quickstart, Biora), realizando la lectura a 595 nm en un equipo
iMark microplate reader de Biorad®.
La diferencia entre
las dos pruebas serológicas (colombiana y venezolana) radica fundamentalmente
en la preparación del AgE/Sfh. En la técnica colombiana se hizo recambio de
medio cada seis horas para seleccionar el momento en que se encontrara la mayor
concentración de proteínas. Además, se corrieron tres protocolos distintos
luego de la liofilización respectiva, dando finalmente cuatro tipos de
antígenos a probar.
Muestras. Los sueros
utilizados para la estandarización fueron analizados para establecer si eran
positivos o negativos a fasciolosis mediante ELISA en la UCV. Se realizó
también el examen coprológico, por la técnica de Dennis modificada para la
búsqueda de huevos de F. hepatica, en el laboratorio de parasitología de
la Universidad Industrial de Santander (UIS), con excepción de algunos que no
fue posible recuperar la muestra.
Sueros humanos. Como
controles positivos de fasciolosis humana se incluyeron seis sueros reactivos
suministrados por el Laboratorio de Inmunología de la UCV y 33 negativos
provenientes del área urbana de la ciudad de Bucaramanga, Santander, Colombia.
Sueros bovinos y ovinos.
Se tomaron 24 sueros positivos de bovinos y 23 de ovinos en zona endémica de
fasciolosis de la Provincia de García Rovira en Santander, y 26 negativos de
bovinos y 27 de ovinos en Zapatoca, Santander, Colombia. Los sueros fueron
analizados mediante ELISA en el Laboratorio de Inmunología de la UCV.
Sueros para estudio de reacciones cruzadas. Para este componente del estudio fueron evaluados 22
bovinos, 21 ovinos y 27 humanos, negativos por coprología y serología a F. hepatica y con presencia de huevos
y/o larvas de otros parásitos en las heces. Los sueros humanos fueron
obsequiados por el Centro de Investigación de Enfermedades Tropicales de la UIS
y analizados mediante ELISA en el Laboratorio de Inmunología de la UCV. Las
muestras fecales se analizaron en el Laboratorio de Parasitología de la UIS.
Los sueros humanos fueron obtenidos de personas
diagnosticadas por coprología o serología a Tenia
sp., Ascaris lumbricoides,
Strongyloides stercolaris, Uncinarias,
Trichuris trichiura, Leishmania sp.,Trypanosoma
cruzi, Entamoeba histolytica, VIH, Toxocara sp., Toxoplasma gondii e Isospora belli. Los sueros de bovinos y
ovinos fueron obtenidos de animales positivos a Trichostrongylus sp.,
Cooperia sp., Eimeria sp., Oesophophagostomun sp., Toxocara sp., Haemonchus sp., Moniezia sp., Ostertagia sp., Paramphistomum sp.,
Nematodiurus sp., y Bonostomum sp.
Estandarización del ELISA.
La concentración inicial de proteína de los antígenos fue 7,7 µg/µL para P1;
5,1 µg/µL para P2; 6,9 µg/µL para R50 y 10,5 µg/µL para R100. Las
concentraciones de cada uno de los cuatro antígenos para cruzar con los otros
parámetros en la estandarización del ELISA fueron 1, 1,5, 2,5 y 5 µg/ mL,
procedimiento que se realizó en la misma placa (Greiner bio-one®. Apogent ®.
Fondo plano). Como bloqueadores se ensayaron leche descremada al 1 y 5%, leche
de soya al 1 y 5 % y gelatina al 0,2 y 0,5%. Todos los ensayos se realizaron
con solución bloqueadora.
Las diluciones
utilizadas de los sueros (controles y desconocidos) fueron: 1/100, 1/200 y
1/500 para humanos; 1/200, 1/500, 1/800 para bovinos y 1/100, 1/200, 1/500 y
1/1000 para ovinos. Las diluciones probadas del conjugado anti-IgG fueron
1:10.000/20.000/30.000 y 50.000 para ovinos-bovinos y 1:30.000/40.000 y 50.000
para humanos. El substrato utilizado fue ortofenil-dietanolamina (OPD) probado
en concentraciones de 2, 4, 6, 8, 10 y 20 mg/placa.
Procedimiento. El
ensayo inmunoenzimático se realizó de acuerdo a Voller, et al.(22)
La sensibilización de los pozos se hizo con 100 µL del antígeno en buffer
carbonato (pH 9,6) por 18 horas a 4°C. Se efectuaron tres lavados con PBS-Tweem
20 por dos minutos y luego incubación durante una hora a 37°C de 100µL de los
sueros diluidos; se realizaron nuevos ciclos de lavados anteriores y se
adicionó 100µL/pozo de conjugado incubando las placas a 37°C por una hora.
Se retiró el exceso
de conjugado con nuevo ciclo de lavados. Se adicionó 100 µL por pozo de la
mezcla de orto-fenil-dietanolamina (OPD) disuelta en ácido cítrico y fosfato
disódico a pH 5,0 y 10 µL de peróxido de hidrógeno. Las placas se incubaron
ocho minutos, en oscuridad, a 21ºC y la reacción se detuvo con H2SO4
y 2N. Las lecturas se realizaron en un equipo iMark Microplate Absorbance
Reader de Biorad® a 490 nm. Los puntos de corte fueron obtenidos del promedio
de las absorbancias de todos los sueros seleccionados para la estandarización
que fueron negativos, más tres desviaciones estándar.
Análisis estadístico. Para
los cálculos de la sensibilidad, especificidad y el cofeciente Kappa de Cohen
se empleó el paquete estadístico STATA 12.0. Se consideró como patrón de oro,
el ELISA realizado en el laboratorio de inmunología de la UCV, ya que se
conocía a cabalidad la procedencia de las muestras y se demostró su resultado
respectivamente.
RESULTADOS
Antígenos. En la
electroforesis realizada a los cuatro antígenos se observaron bandas de
diferente peso molecular, siendo común en todos ellos los componentes proteicos
entre 28 y 30 kDa (Figura 1).
Figura
1. Electroforesis de los cuatro antígenos probados en la
estandarización
La discriminación
entre controles positivos y negativos fue similar con los cuatro antígenos en las
concentraciones probadas; sin embargo, se seleccionó para la estandarización el
R50, con una concentración óptima de 1,5 µg/mL, porque las absorbancias
observadas fueron más altas dentro del grupo de los positivos.
Estandarización del ELISA.
Las diluciones óptimas de los sueros fueron 1:200 para humanos y ovinos y 1:500
para bovinos; el bloqueador que dio mejores resultados fue la leche descremada
al 5% para las tres especies; las diluciones óptimas del conjugado fueron
1:50.000 para humanos y 1:20.000 para los animales (Tabla 1) y la concentración del sustrato escogida fue la de 10
mg/placa con un tiempo de reacción de 8 minutos a 22°C y bloqueo de la misma
con 50 µL de ácido sulfúrico 2 N por pozo.
Tabla 1. Discriminación entre controles positivos y
negativos utilizando diferentes diluciones de Anti IgG
- No hay discriminación de los
controles positivos y negativos.
+
Poca discriminación de los controles positivos y negativos.
++ Moderada discriminación de los
controles positivos y negativos. +++ Alta discriminación de los controles
positivos y negativos.
Determinación del punto de corte, sensibilidad y
especificidad. Para humanos el punto de
corte fue de 0,15; al comparar la prueba realizada en Colombia con la prueba
realizada en Venezuela, se observó una sensibilidad de 100% (IC95% 54,1 - 100)
y una especificidad de 97% (IC95% 84,2 – 99,9). Para ovinos el punto de corte
fue de 0,18, la prueba colombiana tuvo
una sensibilidad de 100% (IC95% 85,2 - 100) y una especificidad de 85,2% (IC95%
66,3 – 95,8). Para bovinos el punto de corte fue de 0,28 y al comparar las
pruebas se observó una sensibilidad de 100% (IC95% 85,8 – 100) y una
especificidad de 96,2% (IC95% 80,4 – 99,9), respectivamente. El porcentaje de
concordancia entre las pruebas fue alto para las tres poblaciones, con Kappa
mayor a 0,8 (Tabla 2).
Tabla 2. Comparación de los
resultados obtenidos por ELISA realizado en Colombia y por ELISA hecho en
Venezuela.
aVerdaderos Positivos. bVerdaderos Negativos. cFalsos
Positivos. dFalsos Negativos.
No se detectó ninguna
reacción cruzada con los sueros positivos para los diferentes patógenos
evaluados en las pruebas para bovinos, ovinos y humanos; los valores de
absorbancia de estos sueros estuvieron entre 0,03-0,11; 0,05-0,259 y 0,027-0,141,
respectivamente (Figura 2).
Figura 2. Densidad óptica del ELISA de los sueros de las tres especies
con fasciolosis (FH) y después de sueros con otras parasitosis (OP).
DISCUSIÓN
El uso del ELISA como
prueba de tamizaje en fasciolosis ha pasado por un arduo debate, resultado de
diversos trabajos experimentales iniciados en 1978 y que hoy posicionan esta
técnica en un lugar destacado frente a otras herramientas diagnósticas. Uno de
los elementos de controversia ha sido la capacidad discriminatoria de la
técnica, que algunos autores relacionan directamente con el antígeno utilizado(23,24).
Diversas
preparaciones del antígeno se han probado para la estandarización del ELISA:
antígenos somáticos, excretor-secretor, o fracciones de estos. Sin embargo, se ha
dedicado especial atención (lo demuestra el número de trabajos realizados), a
la utilización del AE/SFh completo y sus fracciones, pues se ha demostrado mejor rendimiento con este
antígeno, lo que está en relación directa con la evidencia de que los productos
metabólicos son responsables de una fuerte y temprana respuesta de anticuerpos
en los hospedadores, permitiendo diagnosticar infecciones cuando aún no hay
daño hepático(15,16,17,18,19,20,21).
Los cuatro preparados
del antígeno excretor-secretor de F.
hepatica (AE/SFh), utilizados en el presente trabajo, no mostraron
diferencias importantes en su capacidad discriminatoria entre controles
positivos y negativos al realizar las pruebas preliminares en los ensayos de
estandarización del ELISA para bovinos, ovinos y humanos. Sin embargo, la
fracción R50 fue seleccionada como óptima debido a los valores superiores de
las absorbancias que arrojó en el grupo de los positivos y porque ha sido
reportado como un excelente antígeno por varios investigadores(21),
quienes encontraron fracciones que ofrecen alta sensibilidad y especificidad en
ELISA y Western blot. En este último,
las proteínas de 9, 14 y 27 kDa de la fracción R50 son reconocidas por el 90%
al 100% de los sueros positivos y ninguno de los negativos a fasciolosis, ni
los sueros positivos para otras helmintiosis, incluida la paragonimiosis. Estas
evidencias posicionan a R50 como un excelente antígeno para hacer diagnóstico
masivo en poblaciones humanas, previo a la prueba confirmatoria con las
fracciones específicas identificadas por Western
blot(21).
La sensibilidad y la
especificidad observadas en el presente trabajo muestran un excelente poder
discriminatorio de las tres pruebas estandarizadas teniendo en cuenta las
ventajas de esta metodología(22). Los parámetros hallados en el
presente trabajo muestran una sensibilidad para ovinos, bovinos y humanos de
100% y una especificidad entre 85,2% y 97%, similares a los encontrados por
otros investigadores que oscilan entre 90 y 100% para las dos características
cuando se usa ELISA con el mismo antígeno o fracciones nativas o recombinantes
de él, o mediante ELISA para detectar coproantígenos(17,18,19,20,21,24,25,26,27).
No se observaron
reacciones cruzadas con los sueros probados lo cual diverge de otras
investigaciones que han reportado valores hasta 30% de falsos positivos(27,28,29)
cuando se usa el AE/SFh total. A pesar de ello, los autores refieren que ello
puede deberse a la no utilización de una fracción purificada. Particularmente,
el trabajo de Colmenares, et al.(21) muestra reactividad cruzada en
ELISA y la existencia en Western blot
de varias fracciones del R50, especialmente la de 75 kDa, que son reconocidas
por sueros de personas con paragonimiosis, hidatidosis, anquilostomiosis y
ascaridiosis, lo cual evidencia la necesidad de realizar una prueba de Western blot con la fracción R50
obtenida en el presente trabajo.
Así mismo, la
sensibilidad y la especificidad mostradas por el ELISA estandarizado en el
Laboratorio Central de la Universidad Industrial de Santander para el
diagnóstico de fasciolosis bovina, ovina y humana permiten recomendarla para su
validación en estudios con mayor tamaño de muestra con el fin de poder utilizarla
en el futuro como herramienta de tamizaje.
AGRADECIMIENTOS
El presente trabajo
contiene parte de los resultados obtenidos en el Proyecto de investigación
“Estudio de Fasciolosis ovina y bovina en las veredas Carobobo, Anca, Listara,
Cairasco, Corralfalso y Mortiño de la Provincia de García Rovira, Santander del
Sur; financiado por Colciencias código 110252128902. RC No. 5592011.
Convocatoria 521 de 2010. Programa Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación
Agropecuaria.
A la sección de
Inmunología del Instituto de Medicina Tropical, de la Universidad Central de
Venezuela por su valiosa colaboración expresada en capacitación, diagnóstico de
referencia y permanente asesoría.
CONSIDERACIONES
ÉTICAS
El proyecto fue
avalado por el Comité de Ética en Investigación Científica de la UIS, según
consta en el Acta No. 19 de 2012.
CONFLICTO
DE INTERESES
Los autores
declaramos no tener conflicto de intereses con ninguna institución o persona en
la realización del presente estudio.
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Forma de citar: Sierra
Barcácel R, Martínez Vegal RA, Gutiérrez Marín R, Colmenares CD, Uribe Delgado
N. Estandarización de ELISA para el diagnóstico de fasciolosis bovina, ovina y
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