Patricia Escobar1, Laura Viviana Herrera1, Sandra Milena Leal1, Camilo Durán2, Elena Stashenko2
1. Centro de Investigación de Enfermedades Tropicales (CINTROP), Departamento de Ciencias Básicas, Universidad Industrial de
Santander, Bucaramanga, Colombia
2. Centro de Investigación en Biomoléculas (CIBIMOL), Universidad Industrial de Santander, Bucaramanga, Colombia
Correspondencia: Patricia Escobar, MSc, PhD, CINTROP, Escuela de Medicina, Departamento de Ciencias Básicas, km2 vía
refugio, sede UIS Guatiguará, telf.:(57-7) 6344000 Ext. 3550 - 3565, fax (57-7) 6540808
E-mail: pescobarwww@yahoo.co.uk
Recibido: 1 de noviembre de 2009 - Aceptado: 20 de diciembre de 2009
RESUMEN
Introducción: La quimioterapia actual para enfermedad de Chagas es precaria con solo dos opciones de tratamiento: nifurtimox y benznidazol. Las plantas representan una fuente inmensa de moléculas potencialmente activas contra agentes infecciosos. Objetivo: Determinar la composición química y evaluar la actividad de aceites esenciales de Tagetes, recolectados en Colombia, contra Trypanosoma cruzi y su célula de mamífero hospedera. Materiales y métodos: Los aceites esenciales se obtuvieron de plantas colectadas en diversas regiones de Colombia; se extrajeron por hidrodestilación asistida por la radiación de microondas y se caracterizaron por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas. La actividad de siete (7) aceites esenciales se determinó en epimastigotes, amastigotes intracelulares de T. cruzi y células Vero. Los resultados fueron expresados como la concentración que inhibe (CI50, CI90) o destruye (CC50, CC90) 50 ó 90 % de parásitos o células. Resultados: Los componentes mayoritarios de los aceites fueron estragol, dihidrotagetona y cis-tagetona con diferencias de composición entre las especies de Tagetes evaluadas. Todos los aceites esenciales fueron activos en epimastigotes de T. cruzi. El aceite de T. heterocarpha fue activo contra amastigotes intracelulares (CI5041,35 μg/mL). Los aceites de T. caracasana y T. heterocarpha fueron tóxicos para las células Vero. Conclusiones: Los aceites esenciales obtenidos de T. heterocarpha, T. caracasana y T. zipaquirensis mostraron capacidad para inhibir el crecimiento de T. cruzi. Estudios complementarios de la actividad sus componentes mayoritarios se realizan actualmente. Salud UIS 2009; 41: 280-286
Palabras Claves: Aceites esenciales, Asteraceae, Tagetes, Trypanosoma cruzi, células Vero
Chemical composition and anti-tripanosomal
activity of essential oils from
Tagetes (Asteraceae Fam.) grown in Colombia.
ABSTRACT
Introduction: The current chemotheraphy of Chagas diseases is poor, with only two treatment options: nifurtimox and benznidazole. The plants represent an immense source of potentially active molecules against infectious agents. Aim: To determine the chemical composition and biological activity of Colombian Tagetes essential oils against Trypanosoma cruzi and its mammalian host cell. Materials and methods: Plants were collected in various region of Colombia and essential oils were extracted by microwave-assisted hidrodistillation and characterized by gas chromatography coupled with mass spectrometry. The activities of seven (7) essentials oils were determinate in epimastigotes and amastigotes of T. cruzi and on Vero cells. The result were expressed as the concentration to inhibit (CC50, CC90) or destroy (CC50, CC90) 50 or 90 % of parasites or cells. Results: Estragole, dihidrotagetone and cis-tagetone were the main components of essential oils, with quantitative differences between the evaluated Tagetes species. All essential oils were active in epimastigotes of T. cruzi. T. heterocarpha essential oil was active in intracellular amastigotes (IC50 41,35 μg/mL). The oils from T. caracasana y T. heterocarpha were toxic to Vero cells. Conclusions: The essential oils obtained from T. heterocarpha, T. caracasana and T. zipaquirensis inhibit the growth of T. cruzi. Additional studies on the major components activities against parasites are now under study. Salud UIS 2009; 41: 280-286.
Keywords: Essential oils, Asteraceae, Tagetes, Trypanosoma cruzi
INTRODUCCIÓN
La enfermedad de Chagas es una zoonosis ampliamente distribuida en Latinoamérica donde 15 millones de personas se encuentran infectadas con el protozoario T. cruzi y 75 a 90 millones están expuestas a la infección1. En Colombia se estima que 1.300.000 habitantes han sido diagnosticados en alguna fase de la enfermedad2.
El nifurtimox y el benznidazol son los medicamentos usados para tratar la enfermedad de Chagas. Sin embargo, su baja efectividad en la fase crónica, los prolongados esquemas terapéuticos, la disponibilidad reducida y los efectos adversos que estos medicamentos pueden generar en los pacientes, hacen que los tratamientos disponibles sean insatisfactorios. Algunos medicamentos empleados en otras patología, tales como: alloprurinol, ketoconazol, fluconazol, así como nuevos derivados de los triazoles se encuentran en estudio para ser usados en el tratamiento de esta parasitosis3,4. Frente a este panorama, surge la necesidad de buscar y desarrollar nuevos medicamentos seguros y eficaces en esta patología.
Algunas plantas y sus productos han presentado actividad contra el T. cruzi in vitro. Extractos de Annona muricata, Desmopsis panamensis, Pseudomalmea boyacana, Rollinia exsucca, Rollinia pittieri, Xylopia aromatica5, Albizia zygia6, así como aceites esenciales de Thymus vulgaris7, Syzygium aromaticum, Ocimum basillicum8 han mostrado actividad contra formas extracelulares de T. cruzi, con valores de IC50 entre 10 y 500 μg/mL. Algunos derivados de productos naturales tales como monoterpenos hidroperóxidos y cubeibina inhiben el crecimientos de epimastigotes, tripomastigotes y amastigotes axénicos de T. cruzi con IC50 de 0.5 a 25 μM9,10.
Las plantas del género Tagetes (Familia Asteraceae), conocidas comúnmente como clavelón, maravilla, ruda o estragón, tienen una distribución mundial y comprenden aproximadamente 60 especies, siendo las más comunes T. minuta, T. erecta, T. patula, T. tenuifolia y T. lucida11. Por las características de sus flores tienen usos ornamentales, por su olor anisado sirven como especies en las comidas. En la medicina folklórica, infusiones y extractos se utilizan como antihelmínticos, antiespasmódicos, diuréticos, antidepresivos, antimaláricos y antiinflamatorios12-14. Los aceites esenciales del genero Tagetes presentan diversidad en su composición entre las especies. Terpenos como ocimeno, cimenona, tagetona, estragol, entre otros, se encuentran más comúnmente11,15.
Extractos de algunas especies de Tagetes, tales como T. patula, T. pusila, T. minuta, T. lucida y T. máxima han presentado efectos nematocida, insecticida, antifúngico, antibacteriano, antiinflamatorio y antioxidante12,16-19. Estas actividades biológicas han sido relacionadas con la presencia de piretrina, flavonovides, tienoles y terpenoides. Sin embargo, la actividad de aceites esenciales de Tagetes en protozoarios, como el T. cruzi, no ha sido ampliamente estudiada.
El objetivo del presente estudio fue determinar la composición química y evaluar la actividad de aceites esenciales de Tagetes recolectados en Colombia contra T. cruzi y su célula de mamífero hospedera.
MATERIALES Y MÉTODOS
Plantas, extracción y composición de los aceites
esenciales
Las plantas del género Tagetes fueron colectadas en diversos Departamentos de Colombia (Tabla 1) e identificadas por el doctor Jose Luis Fernendez del Instituto de Ciencias Naturales de la Universidad Nacional de Colombia (Bogotá); los pliegos testigo de cada planta identificada fueron depositados en el Herbario Nacional de Colombia.
Los aceites esenciales se obtuvieron por hidrodestilación asistida por radiación de microondas (MWHD) y la composición fue determinada por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS). Los componentes de los aceites fueron identificados con base en sus índices de retención (IR) y por comparación de sus espectros de masas con los de las bases de datos (Wiley, NIST, Adams).
Parasitos y células
Epimastigotes de T. cruzi (cepa 320I01)20,21 fueron cultivados a 28°C en medio de cultivo de Liver Infusion Triptose (LIT) suplementado con 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (SBFi, Gibco). Las células Vero (ATCC) fueron mantenidas en medio de cultivo de RPMI 1640 (Gibco) suplementado con 5% de SBFi a 37°C, 5% CO2 y 95% humedad.
Aceites esenciales y medicamentos de referencia
Se evaluaron siete (7) aceites esenciales obtenidos de T. heterocarpha, T. lucida, T zipaquirensis y T. caracasana. Como medicamento de referencia se utilizó el nifurtimox (Bayer). Soluciones stock de los aceites y del nifurtimox fueron preparadas en dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma) a una concentración final de DMSO no mayor del 1%. Soluciones de trabajo fueron preparadas en los medios de cultivo antes de los ensayos.
Ensayos de actividad contra el T. cruzi
Los epimastigotes de T. cruzi fueron tratados con diluciones 1:3 de diferentes concentraciones de los aceites esenciales (3,7-100 μg/mL) y del nifurtimox (0,4-11 μg/mL), por 72 horas a 28°C. Parásitos de control fueron mantenidos sin compuesto. La inhibición del crecimiento fue determinada microscópicamente por conteo directo de parásitos en cámara de Neubauer. Los amastigotes intracelulares de T. cruzi fueron obtenidos por infección de monocapas de células Vero con tripomastigotes de T. cruzi durante 24 horas, en un radio de infección parásitos:célula de 10:1. Amastigotes intracelulares de T. cruzi fueron tratados con diluciones 1:3 de diferentes concentraciones de los aceites esenciales (3,7-100 μg/mL) y del nifurtimox (0,1-3,7-μg/mL) por 120 horas a 37°C, 5% de CO2 y 95% humedad. Parásitos de control fueron mantenidos sin compuesto. El porcentaje de infección fue determinado por conteo microscópico en células fijadas con metanol y coloreadas con Giemsa.
Ensayos de toxicidad en células Vero
Se determinó por el método de MTT ((3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5difenil-tetrazolio bromuro)22. Monocapas de células Vero fueron tratados con diluciones 1:3 de concentraciones de aceites esenciales (11,1-300 μg/mL) e incubados por 72 horas a 37°C, 5% CO2 y 95% humedad. Células control fueron mantenidos sin compuesto. Se adicionó el MTT a los pozos con células y se incubó por 4 horas a 37°C para permitir la formación de los cristales de formazán, que fueron disueltos posteriormente con DMSO para la lectura de la Densidad Optica. La concentración fue determinada espectrofotométricamente usando un lector de microplacas (Anthos 2020) y DO de 580 nanómetros (nm) La concentración citotóxica se calculó usando la fórmula: % citotoxicidad=100 x (DO grupo control-DO grupo tratado)/ DO grupo control.
Análisis de resultados
La actividad de los compuestos en epimastigotes y amastigotes intracelulares de T. cruzi fue expresada como la concentración de aceite esencial que inhibe el 50% o 90% de los parásitos (CI50, CI90). La toxicidad en células Vero fue expresada como la concentración citotóxica para el 50% o 90% de las células (CI50 CC90). Los anteriores parámetros fueron calculados usando regresión sigmoidal (Msxlfit™; ID Business Solution,UK). El índice de selectividad de los aceites fue calculado como el cociente de la CC50 y la IC50. Cada concentración se evalúo por triplicado y los ensayos fueron realizados dos veces.
RESULTADOS
Componentes de los aceites esenciales
Se identificaron 19 componentes principales (Tabla 2). Estragol fue el componente mayoritario en T. lucida (91,4 y 96,6%); dihidrotagetona en T. zipaquirensis (42,0; 24,4 y 35,7%); cis-tagetona en T. caracasana (58,4%). En el aceite esencial de T. heterocarpha los componentes cis-tagetona y dihidrotagetona alcanzaron cantidades relativas de 16,0 y 13,3%, respectivamente.
Actividad contra el T. cruzi:
Todos los aceites esenciales fueron activos en las formas de epimastigotes de T. cruzi con valores de CI50 entre 4,56 y 21,30 μg/mL; el aceite esencial de T. caracasana fue el más activo, sin embargo con relación al nifurtimox fue 5 veces menos activo (Tabla 1). Los IS en epimastigotes fueron >3 en todos los aceites.
En amastigotes intracelulares el aceite esencial de T. heterocarpha fue activo (CI50 41,36 μg/mL), pero con relación al nifurtimox (CI50 0,46 μg/mL) este aceite fue aproximadamente 90 veces menos activo. Los aceites esenciales de T. lucida, T. caracasana y T. zipaquierensis fueron parcialmente activos (Tabla 1).
Actividad en células Vero:
Los aceites esenciales de T. caracasana y T. heterocarpha fueron tóxicos para las células Vero con valores de CC50 de 25,73 y 43,03 μg/mL, respectivamente.
DISCUSIÓN
Los aceites esenciales obtenidos de plantas colombianas del género Tagetes mostraron una variedad en su composición química, actividad contra T. cruzi y toxicidad moderada o nula en células de mamífero.
La composición química de los aceites esenciales evaluados reveló diferencias de acuerdo con la especie. Las principales variaciones en la composición se presentaron entre las cuatro especies, mientras que ínterespecie las diferencias se relacionaron con la concentración y no con el tipo de componentes. Sin embargo, otros estudios han reportado variaciones intra-específicas que permiten agrupar los aceites de una misma especie de Tagetes en subtipos11. Gil et al (2000) establecieron la existencia de tres quimiotipos de aceites esenciales de T. minuta. El Quimiotipo 1: relacionado con Z-β-ocimeno, dihidrotagetona, Z-tagetona, E- y Z-tagetenonas y limoneno; Quimiotipo 2: con dihidrotagetona y Quimiotipo 3: con α-fenandreno y E- β-cimeno. Las variaciones químicas intraespecíficas en aceites esenciales han sido establecidas en más de 400 especies y familias y pueden estar relacionadas con las marcadas diferencias en la actividad biológica de los aceites esenciales de la misma especie23. Por otra parte, estudios han reportado componentes característicos del aceite esencial de T. lucida como el linalool, estragol (45%) y metil-eugenol11; similares a los encontrados en el aceites esencial de la especie estudiada en el presente trabajo.
Diversas especies de Tagetes han mostrado actividad biológica in vitro. Extractos de T. terniflora, T. minuta y su flavonoide, quercetagetina, han mostrado actividad contra bacterias como Escherichia. coli, Stafilococcus aureus, S. epidermidis y P. aureginosa 18,24. Extractos de T. patula han mostrado actividad antifúngica, antibacterial y nematocida como resultado de la acumulación de tiofenos fototóxicos25-27. Aceites esenciales obtenidos de T. minuta y T. erecta poseen actividad frente a larvas y adultos de Anopheles stephensi 11. Extractos de T. lucida han mostrado actividad contra S. aureus, Candida albicans. Este mismo extracto fue evaluado frente a epimastigotes y tripomastigotes de T. cruzi, sin embargo, no presentó actividad (CI50 > 1 mg/ml) 28,29.
En el presente estudio, se demostró por primera vez la capacidad que tienen los aceites esenciales obtenidos de T. heterocarpha, T. caracasana y T. zipaquirensis T. de inhibir el T. cruzi. La actividad de los compuestos mayoritarios de estos aceites en las formas parasitarias está siendo evaluada actualmente.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen a COLCIENCIAS por la financiación de este trabajo a través de el Centro de Investigación de Excelencia CENIVAM (Contrato No 432-2004) y a la Universidad Industrial de Santander.
CONFLICTO DE INTERES
Los autores declaran no tener conflicto de interés con los datos descritos en este artículo.
REFERENCIAS
1. Coura JR., Dias JC. Epidemiology, control and surveillance of Chagas disease: 100 years after its discovery. Mem Inst Oswaldo Cruz 2009;104 suppl 1: 31-40.
2. Ghul Felipe. Chagas diseases in Andean countries. Mem Inst Oswaldo Cruz 2007,102 (suppl 1):29-37.
3. Coura J:R. Present situation and new strategies of chagas disease chemotherapy a proposal. Mem Inst Oswaldo Cruz 2009;104(4): 549-54.
4. Urbina J. Specific of chemotherapy of Chagas disease: Relevance, current limitations and new approaches. Acta Trop. 2009, en prensa.
5. Osorio E, Arango G, Jiménez N, Alzate F, Ruíz G, Gutiérrez D. et al. Antiprotozoal and cytotoxic activities in vitro of colombian Annonaceae. J Ethnopharmacol. 2007;111(3): 630-35
6. Ndjakou Lenta B, Vonthron-Senecheau C ,Fongang Soh R, Tantangmo F, Ngouela S.Invitro antiprotozoal activities and cytotoxicity of som selected Cameroonian medicinal plants. J Ethnopharmacol. 2006;111(1): 8-11.
7. Santoro Y, Cardoso M, Guimaraes L, Mendoca L, Soares M. Trypanosoma cruzi: Activity of essential oil of Achilleum millefolium, Syzygium aromaticum,Ocimum basillicum on epimastigotes and trypomastigotes. Exp Parasitol. 2007;116:283-290.
8. Santoro Y, Cardoso M, Guimaraes S, Salgado A, Menna-Barreto R, Soares M. Effect of oregano (Origanum vulgare L.) and thyme (Thymus vulgaris) essential oils on Trypanosoma cruzi (protozoa:Kinetoplastida) Growth and ultraestructure. Parasitol Res. 2007;100:783-790.
9. Kiuchi F, Itano Y, Uchiyama N, Honda G, Tsubouchi A, Nakajima-Shimada J.Monoterpene Hydroperoxides with trypanocidal activity from Chenopodium ambrosioides. J.Nat.Prod. 2002; 65: 509-12
10. De Souza V, Da Sila R, Pereira A, Royo V, Saravia J, Montanheiro M, et al.Trypanocidal activity of (-)-Cubebin derivates against free amastigote forms of Trypanosoma cruzi. Bioorg Med Chem. 2005, 15:303-7
11. Vasudevan P, Kashyap S y Sharma. Tagetes: a multipurpose plant. Bioresour Technol. 1997; 62: 29-35.
12. De las Heras B, Slowing K, Benedi J, Carretero E, Ortega T, Toledo C, et al. Antiinflammatory and antioxidant activity of plants used in traditional medicine in Ecuador J. Ethnopharmacol. 1998; 61: 161166
13. Abad M.J, Bernejo P, Palomino S.S, Chiriboga X, Carrasco, L. Antiviral activity of some South American medicinal plants Phytother. Res. 1999 13: 142146
14. Lorenzo D, Loayza I, Dellacassa E. Composition of the essential oil of Tagetes maxima Kuntze from Bolivia. Fragr Flavour. J. 2002;17: 115118.
15. Gil A, Ghersa C.M, Leicach S. Essential oil yield and composition of Tagetes minuta accessions from Argentina. Biochem System Ecol. 2000;28: 261-274.
16. Singh S,Sharma P, Vats L. Light dependent toxicity of the extract of plant Tagetes erecta and α-terthienyl toward larvae of mosquito Culex tritaeniorhynchus. Toxicol. Environm. Chem 1987;16(1): 81-88.
17. Mares D, Tosia B, Poli F, Andreotti E, Romagnoli C. Antifungal activity of Tagetes patula extracts on some phytopathogenic fungi: ultrastructural evidence on Pythium ultimum. Microbiol Res. 2004;159: 295304.
18. Tereschuk, M.L, Riera, M.V, Castro G.R, y Abdala, L.R.Antimicrobial activity of flavonoids from leaves of Tagetes minuta. J. Ethnopharmacol. 1997;56: 227232
19. Parejo I, Bastida J, Viladomat F, Codina C. Acylated quercetagetin glycosides with antioxidant activity from Tagetes máxima. Phytochemistry. 2005;66: 23562362.
20. Luna KP, Jaramillo CL, Gutierrez R, Esteban L, Angulo VM. Aislamiento de T. cruzi en pacientes en fase crónica de la enfermedad de Chagas por medio de hemocultivo y xenocultivo. Biomédica. 2003; 23:119.
21. Luna KP, Jaramillo CL, Hernández G, Gutiérrez R, Vallejo GA, Angulo VM. ITSRFLP-and RAPD-based genetic variability of Trypanosoma cruzi I, human and vector strains in Santander(Colombia). Parasitol Res. 2009; 105: 519-528.
22. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Inmunol. Meth. 1983; 65: 55-63.
23. Nemeth E.Z, Hethelyi E, Bernah J. Comparison studies on Tanacetum vulgareL. chemotypes. J. Herbs Spices Med. Plants 1994;2: 85-92.
24. Tereschuk M.L, Baigor M.D, Abdala L.R. Antibacterial activity of Tagetes terniflora. Fitoterapia 2003;74: 404-406.
25. Hudson J.B, Towers G.H.N,. Therapeutic potential of plant photosensitizers. Pharmacol. Therapeut. 1991;49: 181222.
26. Romagnoli C, Mares D, Fasulo M.P, Bruni A. Antifungal effects of α-terthienyl from Tagetes patula on five dermatophytes. Phytother. Res.1994;8: 332336.
27. Mares D, Tosi B, Romagnoli C, Poli F. Antifungal activity of Tagetes patula extracts. Pharm Biol. 2002;40: 400404.
28. Caceres A, López B, Gonzalez S, Berger I, Tada I, Maki J. Plants used in Guatemala for the treatment of protozoal infections. I. Screening of activity to bacteria, fungi and American trypanosomes of 13 native plants. J Ethnopharmacol. 1998;62: 195-202.
29. Muelas-Serrano S, Nogal J.J, Martínez-Díaz R.A., Escario J.A, Martínez-Fernandez A.R, Gómez-Barrio A. In vitro screening of American plant extracts on Trypanosoma cruzi and Trichomonas vaginalis. J Ethnopharmacol. 2000;71: 101-107